细胞薄层培养在植物激素调节形态发生研究中的应用

生物相关的

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收稿　2002206224　　　　修定　2002210216

资助　江苏省教育厅高新技术产业化开发项目(J H202086)、广东

省科委项目。

　3　现为浙江大学生命科学学院博士生。33　通讯作者(E 2mail :guowm @http://www.77cn.com.cn )。333　现工作单位:上海市松江区农委。

细胞薄层培养在植物激素调节形态发生研究中的应用

赵云鹏3　郭维明3

3

　陆红梅3

33

(南京农业大学园艺学院,南京210095)

Application of Thin Cell Layer Culture in Study on Morphogenesis R egulated by Phytohormones

ZHAO Yun 2Peng 3,GUO Wei 2Ming 33

,LU Hong 2Mei 3

33

(College of Horticulture ,N anjing A gricultural U niversity ,N an 2

jing 210095)

提要　从外源激素对形态发生的调节、植物激素的作用机制、形态发生的内源激素动态等方面概述了细胞薄层培养在植物激素诱导与调节形态发生研究中的应用进展,并对其在植物信号转导、玻璃化现象的发生机制、离体再生障碍的克服等研究领域的发展前景和尚存在的问题作了讨论。关键词　细胞薄层培养;植物激素;形态发生

细胞薄层培养(thin cell layer culture ,TCL cul 2ture ),最初是指从外植体表皮部位撕下一块长5mm 、宽1mm 、厚3～6层细胞(包括表皮、亚表皮及

皮层细胞)的薄片置于适宜培养基上进行的固体或液体培养;现在将外植体横切成厚约1mm 薄片(transverse TCL ,t TCL )的培养也称为薄层培

养[1,2]。细胞薄层培养最早是1970年Tran 和Dri 2ra [1]以隆克舟萼苣苔(N autilocalyx lynchii )的叶表

皮组织为外植体,获得根和芽的分化,成功地建立了植物细胞薄层培养系统。之后,他们实验室又继续在细胞薄层领域广泛开展了研究,并发展了t TCL 系统[3～8]。张丕方等[9,10]改进了TCL 系统

的培养观察方法,此法可对植物形态发生过程作活体连续观察。Madsen 等[11]建立了以茎节切片为外植体的n TCL (nodal TCL )再生系统。

迄今,采用TCL 系统研究的工作很多,在植物细胞的分裂、分化,植物生长发育的调控机制与分子机制等研究中均取得了重要进展[1,2,12,13]。由于TCL 外植体内源激素含量低,对外源激素反应敏感,在不同种类与浓度外源激素作用下形态发生途径多样,同时采用这一系统还可以有目的地安排器官分化的顺序,查明分化的器官基本上来源于相同的细胞层,而且这个细胞层内的每个细胞几乎都参与了作用,在大外植体和愈伤组织系统中则只有少数细胞发挥作用,因此此种体系是一个可以控制的良好实验体系,此项技术已成为研究植物激素诱导与调节形态发生的有效手段。本文介绍细胞薄

层培养在此领域中的应用进展情况。1　用于研究外源激素对形态发生的调节

离体形态发生是组织培养、原生质体培养、遗传转化、无性系变异与突变体筛选的基础。大量研究表明,在形态发生的诸多影响因子中,植物激素起着重要的作用。各类植物激素的生理作用虽具有相对专一性,但是植物的各种生理效应(包括形态发生)是不同种类激素之间相互作用的综合表现[14]。

1.1　研究生长素和细胞分裂素对形态发生的调节

　由于植物细胞在离体培养初期往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力,但是在大多数情况下,这些细胞的分裂和分化及形态发生又必须有这两种激素的共同作用,因此在多数植物组织培养中,外源生长素和细胞分裂素是细胞离体培养所必需的激素。两者不同浓度和配比或先后配合使用,不但可诱导细胞分裂和生长,而且能控制细胞分化和形态发生。

1973年,Tran [15]取烟草(N icotiana tabacum ‘Wisconsin38’

)成花茎段表皮,通过调节培养基中5

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生长素与细胞分裂素的比例以及糖的浓度,在外植体上直接诱导分化出花芽、营养芽、根、愈伤组织,他们进一步报道指出激素种类和用量是分化何种器官的关键。Duong 等[4]用t TCL 培养麝香百合(L ili um longif lorum )幼茎的结果就充分证实了这

一点。他们发现,在相同的基本培养基和培养条件下,添加5.4μmol ?L -1NAA 导致小鳞茎的发生,2.2μmol ?L -12,42D 导致根的发生,1.0、

2.0μmol ?L -1IBA 分别诱导芽和小鳞茎,1.1、2.2μmol

?L -1噻重氮苯基脲(thidiazoron ,TDZ )分别诱导了原球茎和芽,5.4μmol ?L -1NAA +0.4、1.1、2.2μmol ?L -1TDZ 结合处理都有体细胞胚胎发生,而与前者相同浓度的NAA +BA 组合处理产生愈伤组织或小鳞茎。正是由于TCL 培养形态发生具有途径多样的优点,因而不同种类和浓度激素调节形态发生的研究得以顺利进行。

花芽分化的研究有一定的理论和实践意义,一直是形态发生研究领域中的焦点。由于TCL 培养系统在适宜条件下能比较稳定地离体培养成花,因而在相当长时期内它一直受从事离体成花研究的人们所重视,以TCL 培养为实验系统研究成花的报道约占成花研究报道总数的一半。至今还未见到无激素条件下TCL 培养可以成花的报道,在外源激素中以细胞分裂素最为重要,生长素次之。Van 等[16]在烟草品种‘Samsun ’的果柄薄层细胞

培养中,进一步看到植物激素对花芽形成的控制作用。BA 和NAA 浓度低于0.1μmol ?L -1时,TCL 外植体褐化、死亡;二者浓度为0.1μmol ?L -1时,外植体虽不死亡但也不能进一步发育;BA 浓度高于0.1μmol ?L -1,外植体成花数就迅速增加,且几乎与BA 浓度的对数呈线性关系。花芽的分化主要取决于细胞分裂素的浓度,而生长素对花芽形成的作用较为复杂,它取决于花芽发育时期,即在低浓度(0.1μmol ?L -1)NAA 中培养前10d 的成花数

比高浓度(1μmol ?L -1)NAA 中的多,在10d 后这一差别逐渐消失;高浓度NAA 虽对花芽的诱导不合适,但对花芽的进一步发育有利。KT 对花诱导具有特异作用,即专一发生花的TCL 外植体全部是在含有KT 或其衍生物的培养基中发现的,而且KT 和IBA 浓度相等(1μmol ?L -1)时所诱导的成

花率达100%[2]。实验表明,等摩尔浓度(1μmol ?L -1)的细胞分裂素和生长素对花芽形成最合适。

另一类具有细胞分裂素活性的活性物质———苯基脲衍生物(PUD )对一些植物外植体的形态发生,尤其是芽的分化和发育有很强的促进作用。如

10μmol ?L -1N 2(22氯242吡啶基)2N 2苯基脲(CP 2PU )可诱导钻喙兰(R hynchostylis gigantean )t TCL

再生芽生根[8],离体培养的麝香百合(L ili um longif lorum )假鳞茎t TCL 在含1和3μmol ?L -1CPPU 的培养基上每个外植体分别产生16.81和16.26个芽[17]。10μmol ?L -1TDZ 预处理菜豆(Phaseol us v ul garis )种子,可显著提高其t TCL 再

生芽频率;但培养超过2周以上,则抑制t TCL 再生芽和根的发育[5]。CPPU 还可诱导柠檬(Cit rus

li mon )和香橙(C.si nensis )的柱头和花柱的t TCL

外植体产生体细胞胚胎[18]。不同种类的细胞分裂素组合诱导形态发生比使用单一种类更有效[7,8]。

如TDZ 和BA 组合使用对枳壳(Ponci rus t rif olia 2

ta )t TCL 的响应和芽的再生比二者各自单独使用

时更有效[7]。2,42D 可诱导蟆叶秋海棠(Begonia rex )表皮细胞的无丝分裂[10]和人参(Panax gi n 2

seng )子叶t TCL 的直接体细胞胚胎发生[19];但它

抑制柠檬和香橙的柱头和花柱t TCL 的体细胞胚胎发生:除柠檬柱头t TCL 在2,42D 0.4μmol ?L -1时有2.3%的诱导率,其余t TCL 在0～4μmol ?L -1范围内,均无体细胞胚胎发生[18]。

1.2　研究其它激素对TC L 形态发生的调节　G A

影响TCL 形态发生的报道不多,有人报道添加G A 3会抑制TCL 培养物的花芽分化[12],另有报道

认为G A 3也能促进TCL 产生的营养芽芽体的伸长[7]。多胺对形态发生的作用尤其是亚精胺对花芽分化调节的报道较多,许多研究表明外源亚精胺促进TCL 花芽分化。烟草花梗TCL 在营养芽诱导培养基上再添加0.5～5μmol ?L -1亚精胺后即有花的发生,否则没有;添加20μmol ?L -1环己胺(亚精胺合成抑制剂)则抑制花芽分化,诱导营养芽

分化,提高外源亚精胺的浓度可逆转抑制作用,其它多胺则不能[20]。外源腐胺可促进TCL 分化根[21]。

2　用于研究植物激素的作用机制

植物激素调控着细胞生长与分化的方向和进度,这促使人们致力于研究其最初作用部位、信息传递途径和作用机制等,以期进一步揭示细胞脱分化和分化的内在机制。近年来应用TCL 培养对植

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物激素作用机制的研究多集中于植物激素结合蛋白、开花特异基因的克隆和鉴定等方面。2.1　植物激素结合蛋白　Trewavas [22]认为植物

激素作用的强弱与其浓度无关,植物细胞对激素敏感性才是激素作用的控制因素,敏感性的强弱由细胞内激素受体的数目和亲和性决定。因此,受体的鉴定是研究激素作用机制的第一步,而结合蛋白的研究则是研究激素受体的关键。

生长素结合蛋白(auxin 2binding protein ,ABP )研究最多的是玉米胚芽鞘生长素结合蛋白ABP1及其类似物,其它试材少见报道。已有报道证实玉米ABP1主要分布于胚芽鞘表皮与亚表皮薄壁细胞中[23]。高启祥等[24]以烟草花梗TCL 为材料,以免疫荧光显微镜观察培养前后的花梗薄层细胞,发现烟草花梗薄层中ABP1主要集中分布于表皮及亚表皮1～2层细胞内,并证实烟草中生长素作用的靶部位也是表皮,与玉米中的定位相似。这一结果可解释去表皮的花梗TCL 在相同培养基上不分化,而仅产生愈伤组织的现象。同时发现不同分化期ABP1在花梗薄层原生质体中的表达强度有动态变化,细胞分裂旺盛期表达最强,分化后期减弱至培养前水平。烟草ABP1多克隆抗血清的West 2ern blotting 结果表明,其分子量约为26kD ,与玉

米ABP1分子量为20～30kD 的报道相似。研究薄层细胞中ABP1分布及细胞分化中ABP1表达,有助于阐明生长素在细胞分化中的作用机制。

以小麦为材料研究细胞分裂素结合蛋白的结果较多,多存在于核糖体、细胞液和叶绿体中,其受体功能均未鉴定。在烟草TCL 中证实SAHH (S 2adenosyl 2L 2homocysteine hydrolase )是一种CT K 结

合蛋白[25]。它催化SAH +H 2O [腺苷+L 2同型半胱氨酸,是S 2腺苷甲硫氨酸(SAM )依赖型转甲基酶的竞争性抑制剂,它通过调节细胞内SAH/SAM 比例来调节细胞内转甲基作用,影响基因表达,从而调节形态发生。反义导入SAHH 基因的烟草植株表现出明显矮化,顶端优势削弱,侧芽数增加,叶片衰老延缓等CT K 的典型生理效应。检测结果显示,形态发生变化明显的转基因植株无SAHH 基因的转录产物,DNA 甲基化程度较低,叶片内源CT K 水平较高。可能是由于SAHH 缺乏,导致DNA 甲基化不足而引起基因表达发生变化,影响CT K 的生物合成、代谢和信号转导途径,从而提高

了内源CT K 的水平[26]。

2.2　植物激素对转基因植物TC L 形态发生的调

节　Altamura 和Capitani [27]将含编码生长素合成相关酶基因的TR 2DNA 和含可能编码使生长素2葡萄糖结合物释放游离态生长素相关酶基因的TL 2DNA 通过发根农杆菌转化烟草后,取均已进入成

花决定状态的正常植株和转基因植株进行TCL 培养。前者只有在含1μmol ?L -1KT 的培养基上才能开花,而后者在无激素、1μmol ?L -1NAA 、1μmol ?L -1NAA +1μmol ?L -1KT 培养基上均能不同程度地产生花芽。转基因植株中内源生长素水平上升,外植体对外源生长素的敏感性提高,均可能促进其成花决定的表达水平。

2.3　植物激素调节的开花相关基因的克隆和鉴定

　Meeks 等[28]用32P 标记的烟草成花和成营养芽TCL 的cDNA 进行cDNA 文库的差异筛选,分离到

花诱导期间优先或特异表达的5个基因家族(FB721～FB725),而在培养前的TCL 中未见其相应的转

录产物。在实生苗花前分生组织和花分生组织中发现FB721和FB722的转录产物,而营养分生组织和幼嫩的分生组织中没有;在花形成前和花形成期(尤其是前期)植株的根中检测到FB721、FB722、FB725的大量转录产物,而在成根TCL 和幼龄植

株的根中没有。这些结果可能与激素作为开花信号物或激素诱导的开花信号物在根和顶端间的运输、发生于转录水平的变化及其它同源基因的表达有关。FB 基因测序发现,FB721、FB723、FB725分别编码几丁质酶、伸展蛋白和葡聚糖酶,几丁质酶、葡聚糖酶与细胞壁的水解和内源寡糖的释放有关[2]。寡糖可抑制TCL 培养物形成根,并在IBA 和KT 浓度适宜于形成花芽的条件下促进花芽形成[29]。

Tanaka 等[25]采用差异筛选,在烟草TCL 的花

芽形成早期分离到含编码SAHH 基因(DDBJ )的cDNA 克隆,并以该cDNA 为探针从烟草基因组文

库中分离到DDBJ 。Northern blotting 分析显示,DDBJ 在雌蕊和根中的表达量最大,并能受KT 和IAA 诱导表达。SAHH 可能与基因表达的调控、CT K 的信号转导以及花芽分化有关。这一实验再

次提示,根在花芽分化中的作用不可忽视,它可能是开花信号物的合成部位。将SAHH 基因反义导入烟草后,部分再生植株雄蕊即变短,甚至瓣化,可

7

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能是内源CT K 水平提高后,特殊的开花同型基因(floral homeotic gene )的表达发生改变的结果[26]。

只有从分子水平上研究这一问题,才能从本质上揭示植物形态发生的机制,但迄今为止,这一领域的工作仍集中于花芽分化机制的研究,其它类型形态发生机制的研究尚未见报道。3　TC L 形态发生过程中内源激素的变化

植物细胞离体形态发生过程并非是某类激素单独作用的结果,内源和外源激素对植物细胞离体形态发生起着相互的连续性作用[30]。外源激素对形态发生的调节最终需通过其对内源激素平衡的影响产生效应[31],因此组织内部和形态发生部位的内源激素代谢动态和平衡是激素诱导形态发生的关键,而内源激素平衡又受诸多因子的共同制约。

3.1　内源激素动态　李颖章和韩碧文[32]将菊苣(Cichori um i ntybus )花梗TCL 接种于BA 1μmol ?L -1+NAA 1μmol ?L -1和BA 1μmol ?L -1+IAA 1

μmol ?L -1的MS 培养基上,分别分化花芽和营养芽。花芽分化过程中内源IAA 、二氢玉米素(dihy 2drozeatin ,DHZ )+二氢玉米素核苷(dihydrozeatin riboside ,DHZR )、iPA 含量显著增加。营养芽分化

过程中内源DHZ +DHZR 、iPA 含量上升明显;而IAA 含量在培养的前7d 下降,随后有所上升,在

芽原基形成时含量达原初水平的2/3。二者Z +ZR 含量变化不明显。可见,花芽分化比营养芽分

化所需的内源IAA/CT K 比值更高。

Fu 等[20]报道,‘Samsun ’烟草TCL 在花芽形

成过程中内源玉米赤霉烯酮(ZEN )水平出现2个峰值,加入ZEN 生物合成的专一抑制剂马拉硫磷(MAL )后,内源ZEN 水平下降,新花芽的发生受

阻,而添加外源ZEN 可再诱导新花芽的发生,表明ZEN 对花芽发生有某种作用。多胺与形态发生尤

其是花芽发生有一定的相关性,G endy 等[13]甚至提出,多胺代谢分析可作为分化、发育、生长的一种标记。他们发现烟草TCL 根的分化,与培养第7天腐胺的合成高峰相关,腐胺/(亚精胺+精胺)比值下降时,根分化受抑制;在培养第4天和第10天添加外源腐胺或亚精胺,只有在含腐胺的培养基上才有根的分化,而且培养过程中尤其培养第7天培养基p H 值的变化对腐胺的诱导效应必不可少。表明腐胺以某种特定的方式起作用,而不仅仅是通

过其阳离子有机酸载体的作用来调节p H 值。3.2　影响内源激素水平的因素

3.2.1　外植体　取自不同发育时期植株、不同生

理状态植株、同一植株不同部位外植体的内源激素水平均有差异。测定菊苣营养生长期茎和进入盛花期主茎的不同节间部位及花梗TCL 内源生长素与细胞分裂素含量的结果表明,营养生长期间植株茎的不同节间部位内源激素从顶端向基部递减。进入花期后内源IAA 含量以花梗部最高,离花梗越近的节位IAA 含量越高;内源细胞分裂素也是以花梗部含量最高,从主茎顶端向下Z +ZR 含量一直递减,但第3、4节间的iPA 和DHZ +DHZR 含量有所上升,之后又迅速下降,第6节间的含量均降为最低,其下近基部的含量又上升。同时发现,花期顶端DHZ +DHZR 及iPA 含量与基部二者含量的倍数都明显大于营养生长期[21]。外植体中残留的内源激素对其形态发生有显著影响。幼龄植株TCL 再生芽和根的频率高于成熟和老龄植株的TCL ,过于老化的TCL 无器官发生,过于幼嫩的TCL 又往往导致玻璃化现象的发生[33]。用烟草开

花植株进行TCL 培养,可以诱导分化花芽,而取自营养生长期烟草的外植体则不能;在同一培养条件下,花枝部位外植体形成的芽都是花芽,而植株基部外植体形成的芽全为营养芽[15]。

3.2.2　外源激素　外源激素对内源激素平衡的影

响主要受外植体对其吸收效率、其在外植体内的运输量与代谢率以及其它内源激素水平变化等因素制约[14]。烟草花梗TCL 在含IAA +ZT 、NAA +BA 的培养基上培养24h 后,外植体内NAA 、IAA

含量急剧上升;而在不含外源激素培养的外植体NAA 含量下降,IAA 含量基本不变[34]。如果将烟

草花梗TCL 先放在不含NAA 的培养基中预培养不同天数后转入含同位素标记NAA 的培养基中培养,则预培养时间短的外植体所吸收的NAA 量较未预培养的高,但吸收的NAA 在6h 内即转化为结合物和代谢物,因此体内游离NAA 水平约下降40%。含10μmol ?L -1NAA 培养基上的外植体对NAA 的吸收量和体内NAA 浓度均高于1μmol ?L -1NAA 培养的外植体,但体内游离NAA 的浓度

反而低于后者[35]。

3.2.3　内源激素自身的变化　内源激素水平还与

合成部位的激素合成效率、激素结合态的形成效

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率、激素代谢速率、游离态与结合态激素的运输效率以及结合态激素的水解速率等有关。烟草花梗TCL 开始培养时,外植体中结合态多胺水平比游

离态高10倍,培养第8天花芽分化时,结合态多胺达到较高水平,而游离态多胺达到高峰,二者比例下降为5。测定表明游离腐胺、亚精胺和精胺含量

均增加,精氨酸脱羧酶(ADC )活性上升,鸟氨酸脱羧酶(ODC )活性下降[31]。4　发展趋势与存在问题

4.1　发展趋势　如前所述,植物激素的种类和用

量是决定形态发生启动和方向的关键,因此通过TCL 形态发生的定性分析来研究激素受体,以及

利用转基因植株的激素含量调节来研究激素的生理作用并进行形态发生的控制是目前研究的热点之一。细胞薄层培养的表皮、亚表皮细胞能对特定因子(信号分子)做出特异反应,进行形态发生,因此采用这一系统研究细胞间的信号转导,将有助于我们对形态发生机制的进一步认识。

寡糖是细胞壁多糖的降解物,其生物活性近年来颇受关注。不同种类的寡糖经分离、鉴定后,需进一步检验其生物活性,TCL 技术即是一个较好的检测方法。如Zabotinal 等[36]发现,豌豆种苗细胞壁果胶降解物的两种片段对荞麦胚轴TCL 生根数的影响相反,并发现经过几个阶段后,细胞获得感受态和分化能力,在根原基形成后终止,但未确定寡糖参与根发生的哪一阶段。

玻璃化现象是植物离体培养中常见的问题。玻璃化苗的抗逆性差、成活率低、质量差,但迄今对其发生机制尚不明了,对其有效的防止方法也不多。G ilissen 等

[33]

发现,取自幼龄烟草植株各节

间的TCL 外植体再生的芽几乎全部发生玻璃化现象,其发生率远远高于成年植株,取自成年植株上部节间的TCL 玻璃化芽的发生率又显著高于其下部节间。但目前国内外尚未见到采用TCL 培养系统研究玻璃化现象的报道,因此我们认为应用TCL 技术有望使这一现象发生机制的研究有所突

破。

TCL 培养可以克服某些植物如椭圆玫瑰树(Ochrosia elli ptica )[37]的离体再生障碍。近几年

来的研究表明,t TCL 培养对许多种类如水稻(O 2

ryz a sativa )

[6]

、枳(Ponci rus t rif oliata )

[7]

、马唐

(Digitaria sangui nalis )[38]等有较高的芽再生率和

较短的再生周期,因此这一技术在经济植物离体快速繁殖中可能有一定的发展潜力。

4.2　存在问题　细胞薄层培养系统有助于揭示发

育过程本质,获取与植物器官分化、发育相关的重要信息。但多数情况下,培养基的选择都是凭经验,迄今对试材的选择、供体植株的状态、内源激素的质量和数量都缺乏确定的理论基础。G A 、ABA 、乙烯等调节TCL 形态发生的研究还有待进一步深入。精细、复杂的细胞薄层培养技术操作,是其在生产中应用的最大障碍,因此如何简化,或操作程式化是这一技术大规模推广的前提,其应用领域也待进一步拓宽。

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93植物生理学通讯　第39卷第4期,2003年8月

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/p66m.html