酵母三杂交应用及研究进展

酵母三杂交系统研究进展

许多生物过程是通过大分子如蛋白-蛋白，核酸-蛋白的相互作用来实现的，对这些大分子间的相互作用的研究有助于揭示生命过程的分子作用机制。酵母双杂交系统是研究蛋白间相互作用的有用工具，随着该系统的广泛应用，在此基础上发展了三杂交系统，研究包括三种成分在内的更为复杂的大分子相互作用，为蛋白-蛋白、RNA-蛋白和小分子-蛋白相互作用的研究提供了新的手段。

1. 酵母三杂交系统的原理

与酵母双杂交系统相同，三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点，许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成。如酵母Gal4转录激活子包括DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活域（activation domain，AD）。将DNA-BD与诱饵蛋白X融合，AD与靶蛋白Y融合，分别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体，并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用，DNA-BD和AD相互靠近，重组成有活性的Gal4转录激活子，DNA-BD与上游激活序列（UAS）结合，而AD则激活下游报告基因（如lacZ或HIS3）的转录。通过检测β-半乳糖苷酶活性可确定LacZ基因的表达水平。此外，HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶（His3p），能使酵母在组氨酸缺陷培养基上生长。3-氨基-1,2,4三唑（3-AT）是His3p的竞争性抑制剂，His3p表达水平高的细胞能在含有较高3-AT浓度的培养基上生长，因此，酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作用的强度。

与酵母双杂交系统不同，三杂交是研究两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个分子使两个杂合蛋白相互靠近。第三个成分不同，可以是蛋白、RNA或小分子。在以蛋白为基础的三杂交系统中，蛋白X与Y的稳定相互作用依赖于蛋白Z的存在，Z介导相互作用或诱导一个蛋白的构象改变（如X），从而促进与另一个蛋白Y的相互作用（图1）。在以RNA为基础的三杂交系统中，DNA结合域（LexA BD或Gal4 BD）与RNA结合蛋白（如MS2-外壳蛋白或Hiv-1 RevM10）融合成第一个杂合蛋白，转录激活域（Gal4 AD）与感兴趣的RNA结合蛋白Y融合成第二个杂合蛋白。第三个杂合RNA分子包含与第一个RNA结合蛋白（MS2或RRE）

结合的位点（RNA）以及与RNA结合蛋白Y结合 图1 蛋白三杂交系统

的位点X。蛋白Y与RNA结合位点X结合形成具 Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system 功能的转录激活子（图2）。在小分子三杂交系统中，第三个杂合分子为异源二聚化的小分子复合物（如Dex–FK506，DeX-Mtx），使BD-X与AD-Y融合蛋白相互靠近，重新组成具有功能的转录激活子（图3）。在SenGupta等[1] 最早提出的三杂交系统中，第一个杂合蛋白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白编码，第二个杂合蛋白Gal4AD-Y由质粒表达，杂合RNA 分子由RNA聚合酶Ⅲ产生，包括RNAse P 5′前导序列和3′尾随序列（位于mRNA终止密码子后）。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4个或多个T残基形成的转录终止子，而许多RNA 结合蛋白识别富含U的RNA靶标，不能被RNA聚合酶Ⅲ转录。Putz等[2]利用RNA聚合酶Ⅱ转录RNA杂合分子，从而避免富含U的靶RNAs成熟前的转录终止。

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图2 RNA介导的三杂交系统 图3小分子三杂交系统

Fig. 2 RNA-dependent three-hybrid system Fig. 3 Small molecule three-hybrid system

2. 酵母三杂交系统的应用

2.1 研究蛋白-蛋白之间的相互作用

酵母双杂交系统是检测蛋白-蛋白相互作用的强有力工具，但仅限于研究两个蛋白之间。为了适用于分析三蛋白复合物，Zhang和Lautar[3]发展了三杂交系统，并利用该系统检验了Grb2介导的表皮生长因子（EGF）受体与Sos蛋白（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子）的相互作用。Tirode等[4]对三杂交系统进行了改进，将带有Met25启动子的第三个蛋白的基因克隆到已经编码Gal4或LexA融合蛋白的质粒上，Met25是条件型启动子，在缺乏Met的培养基中就可诱导第三个蛋白的表达。这样，就可以利用两个重组载体研究三个蛋白之间的相互作用。在一些情况下，诱饵蛋白在与目的蛋白结合前要经过翻译后修饰作用，而双杂交的局限性之一就是在酵母中缺乏一些重要的翻译后修饰作用（如酪氨酸磷酸化）。Osborne 等[5] 利用三杂交系统研究了高亲和性IgE受体γ亚基FcεRIγ,，通过构建重组质粒，向双杂交系统中引入酪氨酸激酶Lck，使SH2结构域磷酸化，从而诱导SH2的构象改变，与FcεRIγ发生相互作用。

利用三杂交系统还可以从cDNA文库中筛选编码桥蛋白的克隆。以Gal4 BD-EGF受体融合蛋白和Gal4 AD–Sos融合蛋白作为诱饵，从cDNA文库中筛选出编码Grb2的蛋白[3]。利用三杂交系统从cDNA文库中筛选出的片段编码的蛋白可能是修饰两个蛋白相互作用的调节蛋白，而从合成文库中筛选到的肽可以作为破坏两个蛋白相互作用的抑制剂，为设计干预病理途径的药物提供了信息。

2.2 研究RNA与蛋白之间的相互作用

酵母三杂交系统可用于检测RNA-蛋白的相互作用。如铁离子调节蛋白（IRP）与铁效应元件（IRE），HIV反式激活蛋白（Tat）与HIV反式激活效应元件（TAR）RNA序列之间的相互作用[1]。利用三杂交系统还可以筛选相互作用蛋白。利用未知蛋白的靶RNA作诱饵筛选cDNA文库，已成功地筛选出大约编码20种蛋白的cDNA片段。将表达杂合RNA的DNA序列克隆到载体上，与BD-MS2一起转入酵母细胞，从AD-cDNA文库中筛选出与性别分化有关的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）fem-3 mRNA 结合因子[6]。利用细胞或病毒mRNA的5′或3′UTR为诱饵筛选出的蛋白，通过影响mRNA代谢如5′和3′的加工，

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核质穿梭，翻译和稳定性等过程来参与蛋白表达的调节。如从cDNA文库中筛选出的编码两个蛋白CUG-BP和XB1的cDNA在拼接过程中与内含子结合。利用三杂交系统，除了能筛选出预期的相互作用蛋白外，还能筛选出未知的蛋白，从而加深我们对RNA结合蛋白功能的认识。用人端粒酶RNA进行三杂交，筛选出hStau蛋白和一个意想不到的核糖体蛋白L22[7]；以波形蛋白（vimentin）3′UTR为诱饵，筛选出HAX-1和EF1-γ两个蛋白。EF1-γ参与了与细胞周期有关的波形蛋白mRNA的翻译，而HAX-1对于波形蛋白在细胞外周的定位是必需的[8]。可见，HAX-1和EF1-γ参与了波形蛋白代谢的两个不同过程。为了鉴定RNP复合物的蛋白组分，Sonoda等[9]对酵母三杂交系统进行了修改，将感兴趣的蛋白与其靶RNA的复合物与LexA BD融合，从cDNA文库中筛选新的RNP结合蛋白。利用Pumilio-hunchback mRNA（NRE片段）复合物筛选出nanos蛋白，然后用三元复合物Pumilio-NRE-nanos作诱饵筛选Brat蛋白，这是迄今为止包括三个蛋白和一个RNA分子相互作用的酵母四杂交的最早报道。

利用酵母三杂交系统，以一个蛋白作诱饵还能筛选出与之结合的RNA分子。利用酵母蛋白Snp1筛选出与之相互作用的同源的U1 snRNA[10]。用鼠hnRNP K筛选人RNA文库，在筛选到的克隆中有很大一部分编码线粒体基因组[11]，表明hnRNP K可能参与了线粒体基因的表达，这是以前无法预料的。

RNA或蛋白的突变体对鉴定生物学相关性是非常有用的，通过RNA或蛋白的部分删除、突变可以确定相互作用的最小结合域。Jaeger等利用该策略研究组氨酸发夹结合蛋白（HBP，又称SLBP）与组氨酸mRNA 3′UTR发夹的结合位点，从pACT-HBP随机突变文库中筛选出5个不能与野生型组氨酸发夹结合的单突变体，这些突变均位于RNA结合域（RBD）内。此外，利用酵母三杂交系统筛选能恢复与组氨酸发夹结合的基因内突变，发现大多数回复突变定位在RBD外。这表明RBD内的几个残基与RBD两侧的区域之间可能存在内部相互作用[12]。

2.3研究小分子-蛋白相互作用

小分子和受体的相互作用调节着许多基本的细胞过程。合成的小分子广泛用于基础生物学研究，是利用药物进行疾病治疗的基础。传统的体外检测小分子结合蛋白的方法主要通过亲和层析（affinity chromatography）、光交联（photocrosslinking）、放射标记配体结合（radiolabelled ligand-binding）等生物化学方法，从复杂的细胞抽提物中纯化蛋白，费时而且费力。小分子三杂交系统（Small-molecule three-hybrid）是在双杂交的基础上引入一个小分子异源二聚体，提供了一种简单易行的快速检测体内小分子-蛋白相互作用的方法。

小分子三杂交系统最初起源于利用具有细胞通透性的二聚化小分子化学诱导剂（chemical inducers of dimeration, CIDs）来促进哺乳动物细胞嵌合受体的寡聚化[13]。小分子配体通过促进与其结合的融合蛋白之间的寡聚化来控制许多与细胞凋亡或增殖有关的信号转导途径，CIDs作为具有潜在基因治疗作用的候选药物，正成为病理学研究的热点。以小分子为基础的三杂交系统可用于鉴定与特异配体相互作用的蛋白。由于地塞米松（Dex）和FK506能分别与糖皮质激素受体（GR）和FKBP12结合，均能透过酵母细胞，具有被修饰而不破坏受体结合的化学特性。将GR与LexA BD融合，而FKBP12与AD融合，在添加含Dex-FK506异源二聚体的培养基中，小分子异源二聚体（Dex）–FK506能使LexA BD-GR和FKBP12-AD二聚化，从而激活报告基因的表达[14]。利用Dex-FK506，成功的从Jurkat细胞的cDNA文库中筛选出编码FKBP的cDNAs。Lin等[15] 发展了Dex–氨甲蝶呤（MTX）酵母三杂交系统，将LexA BD与二氢叶酸还原酶（DHFR）融合，糖皮质激素受体（GR）与AD融合，利用化学合成的异源二聚体Dex–氨甲蝶呤（MTX）诱导LexA BD-DHFR和AD-GR二聚化，从而激活报告基因的转录。Henthorn等将Gal4转录激活子用于小分子三杂交系统，可以从大量的来自不同的生物体和特定哺乳动物组织的Gal4 AD文库中筛选蛋白。

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他们利用该系统筛选鼠cDNA文库，从5×106个克隆中筛选出4个MTX结合蛋白，2个已知的和3个新的GR相互作用蛋白[16]。此外，将逆向双杂交系统与小分子配体筛选技术相结合可用于筛选破坏蛋白相互作用的小分子抑制剂[17]；利用与小分子三杂交类似的系统筛选新的CIDs，这些都是进行病理学研究的有用工具。

3. 酵母三杂交系统的优点及局限性

酵母三杂交提供了一种简单快速检测体内蛋白-蛋白、RNA-蛋白、小分子-蛋白相互作用的方法。由于是在体内进行，蛋白有可能保持其天然构象。此外，它还是检测弱相互作用和瞬时相互作用的敏感方法。与许多体外检测法不同，三杂交系统不需要纯化靶蛋白和抗体。

三杂交系统也具有其局限性，许多重要的蛋白质不在核内，当杂合蛋白超表达时会产生毒性；由于错误折叠或缺乏翻译后修饰而不具功能；具有完整功能的核蛋白由于本身是转录激活剂或抑制剂而被排斥在双杂交之外；核内加工机制可能会导致杂合RNA的截短；一些RNA含有细胞器的靶向定位信号，不能激活核内的报告基因；插入RNA的长度也是决定三杂交活性的一个重要因素，在重组实验中，RNA序列的长度一般应小于150 nt （如TAR, IRE），才能激活报告基因的表达。在小分子三杂交系统中，杂合小分子需要扩散进酵母细胞核，渗透性问题也会限制它的应用。

此外，由于三杂交系统是在体内检测蛋白-蛋白、RNA-蛋白、小分子-蛋白的相互作用，会受到许多细胞参数的影响，导致假阳性克隆增多，给筛选带来困难。而SELEX，噬菌斑测定和T7噬菌体展示技术由于能在体外筛选相互作用蛋白，因此可控性较强。

4. 酵母三杂交系统的发展与展望

酵母三杂交系统具有比双杂交更广阔的应用范围，不仅用于研究蛋白-蛋白之间的相互作用，还为研究RNA-蛋白、小分子药物-蛋白的相互作用研究提供了新的手段。酵母三杂交的研究已经扩展到分析三个或多个蛋白复合物（如筛选RNP复合物中的诱饵结合蛋白），预示着它可能在更复杂情况下得到应用。但由于三杂交结果只是反映酵母细胞内的蛋白-蛋白、RNA-蛋白、小分子-蛋白之间相互作用的可能性，为避免出现假阳性，还必须经过其它的试验（如光交联，放射配体结合，免疫共沉淀等）加以验证。

随着序列数据库和基因组信息的增加，将酵母三杂交与大规模筛选技术相结合，可以为建立贯穿整个基因组的蛋白-蛋白、RNA–蛋白之间的相互作用图谱奠定基础。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ud5f.html