现代医学实验仪器及实验技术

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《现代医学实验仪器与实验技术》

一、简述高效毛细管电泳仪（HPCE）的组成及技术上的重要改进

四大系统组成：进样系统； 分离系统； 检测系统； 数据处理系统 两项重要改进：细内径毛细管； 高电压 二．试述高效毛细管电泳技术在医药学领域中的应用

蛋白质分离、DNA测序、糖分析、手性分离、无机离子分离、单细胞分析等。

检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液及

临床疾病诊断，临床药物监测，滥用药物分析及临床微生物检测等。

药物中主药成分分析，药物中相关杂质的检测，中药中活性成分的分析，中药指纹图谱分析，手性药物分析等 三、简述显微镜在生物领域常用的观察方式及其用途

◆ 明场观察 ◆ 暗场观察 ◆ 相差观察 ◆ 偏光观察 ◆ 微分干涉

◆ 浮雕相称观察 ◆ 荧光观察 四、电镜样品取材时需注意什么？常规使用的固定剂是什么？浓度是多少？

1. 对任何组织，包括活检组织或培养细胞，取材时因注意以下几点： ● 快 ● 小 ● 准

● 低温操作 ● 避免损伤

2. 常规透射、扫描样品多采用2.5%-3%的戊二醛固定液 五、何谓生物样品的反差？如何提高生物样品反

差？

● 反差为所观察样品的像与其背景在亮度上的差别

● 生物样品的反差可通过以下途径来调节 （1）电子染色

（2）在上机操作时调节物镜光阑的孔径大小 （3）调节加速电压的数值 六、常见的电子显微镜种类及其特点？举例说明透射电镜在临床病理诊断的优缺点？如何弥补缺点？

透射电子显微镜、扫描电子显微镜、分析电子显微镜

优点：分辨能力高，可观察小于0.1um的细胞微细结构和各种特殊物质以及病原体。由于其所观察切片厚度为100nm范围，视野小，观察范围局限是其最大缺点

“三片会诊”：即光镜，半薄切片，电镜检查 七、简述定量PCR引物设计通常遵循哪些原则？A、引物与模板的序列要紧密互补。

B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。

E、引物的3?端避免使用碱基A，同时避免出现3 个以上连续相同的碱基。

F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子

八.为什么要用定量PCR而不用普通PCR？ 单纯定性PCR所提供的只是阳性或阴性结果，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的量起着至关重要的作用。

定量PCR常用估计病毒的负荷量、基因表达的上调或下调等监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。

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在一定程度上消除了单纯定性PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。

九、Western blot的目的是什么？ 目的蛋白是否存在在样品当中； 蛋白质的分子大小； 蛋白质量的改变；

蛋白质的表达情况：上调或下调？ 患者和正常人群样品之间的表达差异性

十. 免疫印迹（ Western blot ）的基本原理 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是一抗，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶、同位素或红外荧光标记的二抗反应，经过底物显色、放射自显影或红外荧光扫描仪检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

十一. 何谓流式细胞术？简述其分析用途？ （1）流式细胞术是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料、激光技术、单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。

（２） 分析用途: ① 细胞表面分子或抗原分析；② 细胞内分子或抗原分析；③ 体液中可溶性分子的分析

十二. 流式细胞仪利用传统PI染色检测细胞周期的样品制备步骤

1）制备单细胞悬液于200ul的PBS中

2) 加2ml预冷的70%的酒精中，边加边振动保证细胞不粘连（一般不能用PBS配） 3）置于4摄氏度冰箱过夜

4）2000转离心5分钟，去上清

5）重悬细胞沉淀于PBS中，2000转离心，去上清

6）重悬细胞沉淀于PBS中，轻轻吹打，过300目滤网过滤，调整细胞浓度为106/ul

7)加入100ul PI染液，避光孵育30分钟上机检

测。

十三. 简述生物芯片的类型

生物芯片技术:包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室

基因芯片(Genechip)又称DNA芯片,它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。 蛋白质芯片:利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)，这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。

芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统，它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成，从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，属未来生物芯片的发展方向。

十四. 为什么一提到基因芯片总会首先想到DNA芯片？

（1）与DNA的性质有关。DNA 很稳定不容易降解，保存时间长;

（2）强大的类比性。使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成; （3）巨大的信息产出率; （4）高度敏感性和专一性; （5）高度重复性;

（6）微型化和自动化。

十五. 解释下列染色体的表达式的意思 45, XY, -14, -21, +rob(14;21)(q11;p11)

45条染色体，男性，少一条14号和一条21号染色体，多一条罗氏易位染色体，该染色体为14号长臂1区1带与21号短臂1区1带连接

十六. FISH技术与G显带技术如何结合？有什么优点？

已做过G显带的染色体片子用75%的乙醇或甲

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醇褪色后，可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）

不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析

十七、基因转导技术有哪几类？各举一例说明 1．化学方法：（磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖） 2．物理方法：（脂质体介导的转染、电击转染法、基因枪技术、显微注射法） 3．生物学方法：（逆转录病毒感染、腺病毒感染、慢病毒感染）

十八. 测序的概念？DNA 一级结构的测定方法有哪些？ 1. 测序：确定一条染色体/DNA片断上的碱基顺序。

2. （1）经典方法： Sanger双脱氧链终止法/末端终止法/酶法、Maxam-Gilbert DNA化学降解法

基因转导技术（14周）

基因转移技术

将外源基因转移到受体菌或细胞内,在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。它是重组DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一

方式： 转化 感染 转染 转化（Transformation）：将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程

感染(Infection): λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增

转染(Transfection):是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体等

基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组

/化学断裂法。

（2）新技术方法：杂交测序法、质谱法、单分子测序法、原子探针显微镜测序法、流式细胞仪测序法、大规模平行实测法、DNA 芯片法。

十九、什么是实验室生物安全防护？实验室安全的目的是什么？

实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时，通过在实验室设计建造、使用个体防护装置、严格遵从标准化的工作及操作程序和规程等方面采取综合措施，确保实验室工作人员不受实验对象侵染，确保周围环境不受其污染 推行实验室安全规则，其目的在于防止实验室事故的发生：① 保护自己免于实验室的危害；② 保护他人免于实验室的危害；③ 保护实验室财产和人身安全；④ 为了人性的尊严，生命和健康永远是无价的；⑤ 保护大家共同的环境，创建一个安全愉快的学习、研究环境

中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除

基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进

统称为基因打靶技术（Gene targeting）

常规转染技术可分为两大类： 瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析

稳定转染：也称永久转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，新霉素抗性基因，潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复

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筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 基因转导技术的分类 化学方法： 磷酸钙沉淀法 DEAE-葡聚糖 1. 磷酸钙沉淀法

目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，吸附在细胞膜表面，由细胞内吞作用进入到靶细胞的细胞中，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达 方法简单，但转化效率低

Ca2(PO4)2+DNA → 混合微细颗粒 2. DEAE-葡聚糖和聚季胺盐转染法

? DEAE-葡聚糖或聚季胺盐均可同带负电的DNA分子聚合,形成复合物，与靶细胞作用而传递进入细胞内

? DEAE-葡聚糖具有促进靶细胞摄取DNA的作用

物理方法： 脂质体介导的转染 电击转染法 基因枪技术 显微注射法 1. 电穿孔法（electroporotion） 将细胞置于高压脉冲电场中，通过瞬间高压脉冲电压使细胞产生可逆性的穿孔（打孔），周围基质中的外源DNA可渗进细胞，进而表达 电击转染技术原理

电击转染技术是利用电转导仪在一定的电压、脉冲时间等参数下, 将外源基因导入到细胞中的一种有效方法。它是将细胞置于脉冲电场中，瞬间高压脉冲，这就有可能可逆性地在细胞膜上打出微孔（打孔）

具有操作简单, 耗时少, 节省成本等优点, 但对细胞的损伤较大, 对电压非常敏感, 所以需要有一个合适的电压, 既能使外源基因导入又尽可能让最少量细胞受损伤 影响电击转染的因素：

脉冲电压：最适电压约在200伏左右 电导电路的电容：电压脉冲等于电容量和缓冲液电阻的乘积。

缓冲液的盐度：高盐度减小了电场的阻力,导致电脉冲的作用时间变短，产生的膜孔直径变小 DNA浓度：DNA浓度上升，转导率上升 细胞数量：合适电压与细胞的大小成反比 温度

2. 脂质体介导的转染

脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡,通过细胞的内吞或吞噬作用, 将所携带的目的基因导入细胞中

脂质复合体没有免疫原性, 组织毒性较小, 而且转染脂质体也易于制备, 因此脂质体转染已成为现今用于基因转移的最常用方法 阳离子脂质体介导转染的原理

将DNA或RNA包裹于脂质体内, 然后经脂质体与细胞膜的融合或者细胞的内吞作用导入 阳离子脂质体的表面带有正电荷,其介导的转染是基于和阳离子脂质体之间的离子相互作用, DNA通过形成一个脂质体-DNA复合物再被细胞捕获并最后表达

脂质体复合物进入细胞的方式 吸 附

细胞内吞作用介导的融合 直接与细胞质膜融合

两个关键性特点使得Lipofectamine2000的转染步骤快速简便

?DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中

?转染后不需要除去Lipofectamine2000试剂。对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间

阳离子脂质体试剂转染注意事项

有血清时的转染 在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成

培养基中的抗生素 抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。降低了细胞的活性，导致转染效率低

脂质体介导转染与电穿孔技术合用

如果将脂质体-DNA复合物与电穿孔技术联用, 将有助于提高基因传递的靶向性和肿瘤部位的基因摄取量

3. 显微注射法（microinjection ）

显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内

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体外利用打靶载体对ES细胞进行基因敲除或敲入，再将ES细胞显微注射入囊胚中，移植宿主 显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。 4. “基因枪”技术 “基因枪”技术又称:

粒子轰击(particle bombardment)，

高速粒子喷射技术( High-velocity particlemicroprojection )

or基因枪轰击技术( gene gun bombardment ) 美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等1983年研究成功，1987年应用

基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞（细胞、组织或器官），由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，实现稳定转化的

已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功；初步应用：基因治疗和抗体制备 基因枪法(Biolistic-bombardment)：多用于植物细胞或体内直接转导

生物学方法：逆转录病毒感染 腺病毒感染 慢病毒感染 是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞 目前最常用的病毒载体有：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等

用作载体的“病毒”都是经过人工改造的假病毒，需要在体外包装成具有感染性的完整病毒颗粒，才可感染宿主细胞

病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒

完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移

目前应用最多的最成功的是逆转录病毒（retrovirus）

逆转录病毒载体 优点

① 高效感染宿主细胞，转染率可达100% ② 病毒基因和所载的外源基因都可能表达 ③ 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留

逆转录病毒载体 缺点 ① 病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段

② 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入外源基因可能不适当的表达

③ 逆转录病毒有潜在致病性，使受体细胞癌变

根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号

各转染方法与细胞相互作用的机制以及它们传递分子的类型 转染的方法 与细胞相互作用的机制 传递的分子 DNA RNA 寡阳离子脂质体 通过电荷的相互作用与细胞吸附 √ √ √磷酸钙共沉淀 共沉淀、细胞的吞噬作用 √ 电穿孔 膜上打孔的形式 √ √ DEAE-葡聚糖 通过电荷的相互作用与细胞吸附 √ 聚季铵盐 通过电荷的相互作用与细胞吸附 √ 基因枪技术 膜穿刺 √ √ 细胞核直接微注膜穿刺 √ √ √射

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基因转导技术在生物医学研究中的应用 研究基因功能

转基因动(植)物的制备 疾病的基因治疗 基因工程药物的生产 环境监测和环境净化

基因序列测定及序列分析（13周）

主要内容：

Ⅰ 基因组、基因 Ⅱ 核酸

Ⅲ 核酸的结构与功能

Ⅳ 核酸酶与限制性核酸内切酶

Ⅴ DNA序列分析(DNA一级结构测定) Ⅵ 基因组序列解析 Ⅶ 基因组序列解析举例 Ⅷ RNA测序

Ⅰ 基因组、基因

基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。

任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为基因组（genomes）。

基因组有两层意义：遗传物质和遗传信息。 要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。

各物种基因组特点： 病毒基因组结构特点

1、基因组相对较小且大小相差较大。 2、不同病毒只含一种不同结构核酸。 3、由连续的或不连续的多核苷酸链组成。 4、基因重叠（包含型、交叉型）。

5、大部分用来编码蛋白质（相关基因簇、单

倍体基因组、与寄主基因组结构特征相似）。 细菌基因组结构特点

1、染色体基因组通常只由一条环状双链DNA组成。

2、具有操纵子结构。 3、重复序列少。

4、内含子所占比例小。

5、具有编码同工酶的同基因。 6、基因不重叠。

7、具有多种功能的识别区域。 8、在基因或操纵子序列末端具有特殊终止序列。 真核生物基因组结构特点 1、体细胞的基因组是双份的

真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因组是双份的(即双倍体)，即有两份同源的基因组。

2、转录产物是单顺反子 即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。

3、存在大量重复序列

即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序，重复序列长度可长可短，短的仅含 2 个核苷酸，长的多达数百、乃至上千。重复频率也不尽相同。 高度重复序列：

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长度：几个～几千个bp；拷贝数：几百个～上百万个首尾相连，串联排列，集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等），也称卫星DNA。序列中G-C含量高于DNA的其它结构。 中度重复序列：

一般分散于整个基因组中；长度和拷贝数差别很大。rRNA、tRNA、组蛋白等的基因，大多为中度重复序列。在中度重复序列中，有一类可移动的片段，称为逆转座子。 单拷贝或低度重复序列：

在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列。在真核细胞中，除组蛋白以外，其它所有蛋白质都是由DNA中这种单拷贝序列决定的。该序列大小不等，每一个顺序决定一个蛋白质的结构，称之为结构基因。动物中约占50％；植物中约占20%，因此所含信息量最大。在人基因组中占约60～65%。 4、有很多不编码区域 5、基因是不连续的

在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(intervening sequences)，称为内含子(intron)，编码区则称为外显子(exon)。内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后RNA中的内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA，作为指导蛋白质合成的模板。

6、具有多个复制起点 基因

DNA上具有特定功能的一个片断，负责一种特定性状的表达。一般来讲，一个基因只编码一个蛋白质。

是遗传信息的物理和功能单位，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

基因分类：

编码RNA的基因，如 rRNA、snRNA基因等。 编码蛋白质的基因。

DNA： 两条互补链。由 ATCG 4 个碱基形成的字符串。

RNA： 单链结构。由 AUCG 4 个碱基形成的字符串。 蛋白质： 一条或多条肽链。每个肽链是由 20 种

氨基酸形成的长链，即 20 个字母形成的字符

串。

翻译：每 3 个碱基翻译成一个氨基酸。

Ⅱ 核 酸

一、核酸的概念和重要性

DNA是主要遗传物质： 存在细胞核（95%）和线粒体、叶绿体（5%）中

RNA的功能多样性： 存在胞质（90%）和细胞核（10%）中

核酸的概念：核酸是酸性的大分子物质，在活细胞中与碱性蛋白结合，以核蛋白形式存在。 核酸分为脱氧核糖核酸 ( DNA )、核糖核酸 (RNA)两类，DNA所含核苷酸分子数比RNA大得多。

DNA为线性、双螺旋分子或闭合环状分子。 RNA分为三个类型，即核蛋白体 RNA(rRNA，占总RNA80%)、信使RNA(mRNA，占总RNA5%)和转移RNA(tRNA，占总RNA15%)。

脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比 RNA DNA 戊糖 核糖 脱氧核糖 碱 组成 A、G、C A、G、C 基 U T 磷酸 Pi (磷酸二酯键) Pi (磷酸二酯键) 结构 单链，部分碱基互补，局部双链，碱基互补，双螺旋，三叶草形等 双螺旋形 分布 细胞核(核仁)， 细胞质(线细胞核(染粒体、核蛋白体、胞液) 细胞质(线粒体) 遗传信息表达，反转录，直遗传的物质基础，生物功能 接参与蛋白质的生物合成 负责遗传信息 贮存，发布，转录

核酸重要性：

DNA是遗传的物质基础，负责遗传信息的贮存和发布，遗传基因就是DNA链上的若干核苷酸所组成的片段。

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RNA负责遗传信息的表达，直接参与蛋白质生物合成，转录DNA所发布的遗传信息，并将之翻译给蛋白质，使生命机体的生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行。

核酸类物质RNA的重要功能 ：

酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。

（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成 90°角。 RNA种类 功能 （3）螺旋横截面的直径约为 2 nm，每条链相邻

mRNA 将信息从基因传递到蛋白质 两个碱基平面之间的距离为 0.34 nm，每 10 个

核苷酸对形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一tRNA 携带活化氨基酸参与蛋白质生物合成 圈）高度为 3.4 nm。

rRNA 构成核蛋白体（蛋白质合成场所） （4）双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。A-T，G-CSnRNA 参与mRNA前体剪接加工 碱基的相互结合具有严格的配对规律，结合，这种配对关系，称为碱基互补。A T间形

M1RNA RNase P的催化单体 成两个氢键，G C 间 三个氢键。在DNA分子

中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。 端粒酶RNA 端粒合成的模板 (5)沿中心轴观察，双螺旋结构上有两条螺形凹引物RNA 起始DNA复制 槽，一条较深宽，称为大沟（宽1.2nm，深0.85nm ）；另一条浅窄，称为小沟（宽0.6nm，TsRNA 蛋白质分泌复合物中的一部分 深0.75nm ）。

大沟暴露出嘌呤的 C6N7 和嘧啶 C4C5 及

二、核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸

其取代基团；小沟一侧暴露出嘌呤 C2 和嘧啶

元素组成：C、H、O、N、P

C2 及其取代基团。大沟与小沟对于 DNA 与蛋

P 元素的含量较多并且恒定，约占9～11%。因

白质的相互识别极其重要。

此可通过定磷法测定核酸含量。

碱基(嘌呤或嘧啶)、戊糖(核糖或脱氧核糖) 和磷

DNA二级结构的多态性

酸是核酸（DNA、RNA）的基本构件分子。

DNA二级结构的多态性，是指DNA不仅具

核苷酸是核酸的基本组成单位。

有多种形式的双螺旋结构，而且还能形成三链等

其它结构，说明DNA的结构是动态的，而不是

Ⅲ 核酸的结构与功能

静态的。

一、核酸的一级结构

核酸的构型的多样性是由于核酸主干链上

核酸中核苷酸的连接方式

各键和碱基的旋转造成的，是特定的碱基序列导

核苷酸通过 3′,5′ -磷酸二酯键连接起

致的结果。

来，以磷酸-糖-磷酸-糖…形成核酸骨架

B-DNA螺旋

核酸的表示方式

DNA在92%相对湿度的钠盐中的构型,是细

若不特别注明，核酸的表示方式一般规定从5′

胞正常状态下DNA存在的主要构型。

端书写至 3′端

A-DNA螺旋

DNA、RNA 的一级结构

DNA在75%相对湿度的钠盐中的构型。

核酸的一级结构是核酸中各核苷酸通过

C-DNA螺旋

3′,5′磷酸二酯键连接而成的无分支的多核苷

DNA在66%相对湿度的锂盐中的构型。

酸链。即核苷酸排列顺序。

Z-DNA螺旋

左手的DNA螺旋，这种螺旋可能在基因表

二、DNA的双螺旋结构

达或遗传重组中起作用。

DNA的双螺旋结构特征

（1）DNA分子由两条反向平行的多聚脱氧核苷

三、DNA的三级结构

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DNA的三级结构是指DNA双螺旋结构通过进一步扭曲和折叠所形成的更加复杂的构象,超螺旋是三级结构的主要形式。

自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。 有些单链环形染色体(如φx174)或双链线形染色体(如λ噬菌体)，在其生活周期的某一阶段，将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子，但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。

超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。 超螺旋结构(superhelix 或supercoil)

DNA双螺旋链扭曲或再盘绕所形成空间结构。

正超螺旋(positive supercoil)

DNA双螺旋链盘绕过多时所形成的超螺旋。 负超螺旋(negative supercoil)

DNA双螺旋链盘绕不足时所形成的超螺旋。 意义

DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。

原核生物DNA的三级结构

绝大多数原核生物DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。

真核生物中的核小体结构 在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。

核小体结构属于DNA的三级结构。

核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有 5 种，H1、H2A、H2B、H3、H4 各两分子构成一个八聚体，其外再由双螺旋DNA绕其旋转1.75圈(为DNA的三级结构)，约含140bp ，称为核小体的核心颗粒(core particle)。两个核心颗粒之

间由一段双螺旋DNA链(约60bp)相连，称为连接部。组蛋白H1结合在此部位。若干个核小体再螺旋形成核小体纤维，再进一步螺旋化形成染色体。从双螺旋DNA到染色体，DNA总共压缩了约8000～10000倍. 四、特殊的DNA结构

五、DNA的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。 基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。

六、RNA的结构与功能 RNA的主要种类与功能

RNA是单股核酸分子，多核苷酸链自身折叠、缠绕，以碱基互补配对原则，在许多区域形成茎环结构，其二级结构中有许多修饰碱基。 真核细胞mRNA的结构特点

真核生物mRNA的前体是核不均一RNA经过切除内含子、拼接外显子的加工，形成成熟的mRNA。

大多数真核mRNA的5′末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。

大多数真核细胞mRNA在3′-末端有一段长约20～200核苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。 5′-cap的功能

防止mRNA被核酸酶降解。 为mRNA翻译活性所必需。 与蛋白质合成的正确起始有关。 polyA的功能

保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。

mRNA的功能

把DNA所携带的遗传信息，以密码子的形式，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。 mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板。

mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，

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在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（coden）

转移RNA的结构与功能 tRNA一级结构的特点 Mr较小（Mr25000），沉降常数为4S。

各种tRNA的链长很接近，一般含73～93个核苷酸。

tRNA是保守性最强的RNA，分子中约20多个位置上的核苷酸是不变和半不变的。 各种tRNA的3′端为CCA；5′端大多数为pG，少数为pC。

tRNA分子中含有较多的修饰成分，达10%-20% 。

tRNA二级结构特点

tRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形，故称为“三叶草”结构。

tRNA的“三叶草”形结构包括：氨基酸臂、DHU臂与环、反密码臂与环、可变环和TψC臂与环五部分。

(1)氨基酸接受区

包含有tRNA的3′ -末端和5′ -末端，3′ -末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为核苷。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。 (2)反密码区

与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码

(3)二氢尿嘧啶区

该区含有二氢尿嘧啶。 (4) T?C区

该区与二氢尿嘧啶区相对， 假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷环(T?C)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(T?C臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tBNA在此环中都含有T?C 。 (5)可变区

位于反密码区与T?C区之间，不同的tRNA该区变化较大。

tRNA二级结构的特殊情况

1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。 近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。 tRNA的三级结构

tRNA的三级结构为倒L型。反密码子环和氨基酸臂两个功能区位于倒L型的两个端点，二氢尿嘧啶区和T?C区构成倒L型的拐角。 在tRNA二级结构中未配对的某些并不互补的碱基参与了三级结构中特殊的氢键作用，tRNA链中的核糖-磷酸骨架与某些碱基甚至其他的骨架之间也能产生作用。

tRNA的主要功能

tRNA的作用是多方面的，它通过高度专一的氨 酰-tRNA合成酶识别、活化、携带相应的氨基酸，将氨基酸转运到核糖体上，识别mRNA上相应的密码子，按照mRNA上的密码顺序，将相应的氨基酸装配到蛋白质的特定位点。

所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构，这有利于携带氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。

核糖体RNA的结构与功能

rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA的主要功能是与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。 原核生物 真核生物 核糖体 rRNA 核糖体 rRNA 30s 16s 40s 18s 70s 5s、23s 80s 5s、5.8s、28s 50s 50s 许多rRNA的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。

其他小分子RNA

细胞的不同部位存在着许多其他种类的小分子RNA，如：

核内小RNA（snRNA） 核仁小RNA （snoRNA）

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胞质小RNA （scRNA） 催化性小RNA （ribozyme） 小片段干涉RNA （micRNA） Ⅳ 核酸酶与限制性核酸内切酶 一、核酸酶的分类 按底物专一性：

核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶（DNase） 按作用方式：

核酸内切酶和核酸外切酶 按磷酸二酯键断裂的方式：

水解3′-OH与磷酸之间的酯键，产物为5′-核苷酸；水解5′-OH与磷酸之间的酯键，产物3′-核苷酸。

其它：如双链酶、单链酶等

二、核酸酶的功能

生物体内的核酸酶负责细胞内、外催化核酸的降解；

参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要；

基因复制和基因表达过程负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸；

在消化液中降解食物中的核酸以利吸收； 体外重组DNA技术中的重要工具酶。

三、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶来自于细菌，主要降解非细菌体内的外源未经特殊修饰的双链DNA，对自身起保护作用。它识别及切割的位点常具有回文结构。

限制性内切酶的特征

具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点。

产物具粘性未端或平整末端。

粘性末端-指切割产物片段两端突出的单链具有互补序列。

限制性内切酶的命名

限制性核酸内切酶的类型 Ⅰ型

催化反应需要ATP，同时具有限制酶和甲基化酶两种活性，切点距识别序列约1000bp。

Ⅱ型

反应不需要ATP，在所识别的特殊核苷酸序列内或附近切割DNA链，通常识别位点是由4或6核苷酸组成的回文结构。酶分子本身由两个完全一致的亚基组成，分子量小于80ku，Mg2+是唯一的辅助因子。

是目前被广泛应用于分子生物学的一类酶。 Ⅲ型

反应需要ATP，同时具有限制酶和甲基化酶两种活性，切点距识别序列约10-25bp。

Ⅴ DNA序列分析(DNA一级结构测定) 测序：确定一条染色体/DNA片断上的碱基顺序。 序列测定技术： 经典方法：

英国 Sanger ： 1975年加减法- Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)

美国 Maxam-Gilbert ： DNA化学降解法/化学断裂法 (Maxam &Gilbert,1977) 新技术方法： 杂交测序法 质谱法

单分子测序法

原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法 大规模平行实测法 DNA 芯片法

一、 Sanger双脱氧链终止法（末端终止法、酶法）

在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3′-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3′位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5′ -引物端和以ddNMP残基为3′端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 1.模板与引物杂交。

加入相同的单链DNA模板、引物、4 种dNTP及DNA聚合酶。合成新的互补DNA链。 2.引物的延长和合成阻断

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平行进行四组反应，每组试管分别加入DNA聚合酶、dNTP、标记底物/标记引物。

每组另外再分别加入一定比例的2′ ,3′ -ddNTP（如ddA、ddG、ddC、ddT），使反应随机终止于ddNTP处。

3.任意选取一种脱氧核苷酸为同位素标记物，便于检测。

4.加热变性，凝胶电泳分离，放射自显影检测。

二、 Maxam-Gilbert法 Maxam-Gilbert测序法原理

一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。

Maxam-Gilbert测序过程

1.首先分离纯化一条DNA链，并用 P标记该链5′末端 。

2.反应分四组，选择专一性不同的试剂分别破坏四种碱基中的一种，控制反应条件（温度，pH等），使磷酸核糖骨架在此处断裂。

嘌呤：硫酸二甲酯与哌啶配合使用，在嘌呤碱基处发生断裂。

嘧啶：肼与哌啶配合使用，在嘧啶碱基处发生断裂。

3.凝胶电泳分离,放射自显影检测。

三、杂交法（Sequencing by hybridization ,SBH ） 用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。

四、DNA芯片测序

将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上，每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。待检测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号，然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比

组装，拼接成完全的DNA顺序。

五、自动化测序

与链终止法测序原理相同，只是用不同的荧光色彩标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。

DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化

3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶 干燥，放射自显影。

4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化

2.自动测序仪

Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链

终止测序，用激光扫描阅读序列。

红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）

兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP） 优点：

4个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；

可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；

可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：

无法保留原始记录, 4个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。

1. 鸟枪测序法(shotgun sequencing)

大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子

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DNA序列。

将DNA大片段切割成小片段的方法： 限制性内切酶 超声波处理 DNA酶I降解

基因组DNA序列测定示意图

通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。

鸟枪法测序的缺点

随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。

高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。

2. 引物步移法

将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序才能合成适当的引物进行测序。定向缺失克隆策略、染色体步查法等。

六、DNA片段序列测定的策略 定向测序策略

定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。 随机测序战略

随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy)，此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。 多路测序战略

多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的

一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序。

七．基因组测序

在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个碱基对。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。

序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围300－1000 bp，而目标序列的长度范围是3?100万bp，总的片段数目可达上千个。

DNA序列片段组装（sequence assembly)，又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。

DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。

先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。

另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。

完整基因组的测序过程一般包括3个步骤： 建立克隆的物理图谱

如YAC克隆、BAC克隆等； 利用鸟枪法测定每个克隆的序列；

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序列拼装和注释 当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、 重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。 Ⅵ 基因组序列解析 一、寻找基因 1.根据开放读码框预测基因 1.1 起始密码子—ATG 第一个ATG的确定则依据Kozak规则。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。 若将第一个ATG中的碱基A,T,G分别标为1,2,3位，则Kozak规则可描述如下： 第4位的偏好碱基为G； ATG的5′端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； 在-3,-6和-9位置，G是偏好碱基； 除-3,-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 1.2 信号肽分析 信号肽分析软件—Signal P (http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP） 把预测过程中证实含完整mRNA 5′端的Contig 翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸 Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽;假如在该测试序列的第一

个Met 5′端存在终止密码子，该序列为信号肽的可能性更大。 1.3 终止密码子 终止密码子: TAA、TAG、TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一

次；

GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出

现一次；

由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。 1.4 3′端的确认 3′端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试

Contig不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。 1.4 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少于 100 个密码 子，有的不到 50 个密码子甚至更少。 1.5 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第 3 位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为 GCA,GCC或GCT,而 GCG 很少使用。 1.6 外显子－内含子边界 其边界有一些明显的特征，如:内含子的5′端或称供体位常见的顺序为 5′－AG↓GTTAAGT-3′ ； 3′端又称受体位，多为 5′ -PyPyPyPyPyPyCAG-3′(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)； 1.7上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。

另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。 1.8 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。

2.mRNA的5′端—即转录起始位点区 通过同源性比较来预测 mRNA 的 5′端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库为：

The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter Database,EPD. http://www.epd.unil.ch/ 3.同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。

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同源有如下几种情况：

DNA序列某些片段完全相同；

开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； 模拟多肽高级结构相似。

4.试验分析

Northern 杂交确定DNA片段是表达序列： 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；

考虑组织专一性和发育阶段的问题；

如果基因表达产物丰度较低，用拟 Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。

拟 Northern 杂交—根据已知的DNA顺序设计引物，从 mRNA 群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。 动物园杂交：

根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的 DNA 顺序与来自另一亲缘物种的 DNA 片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有 1 个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交。

二、获取基因全长cDNA序列

构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。

根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。

三、确定DNA顺序中基因的位置 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域； 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置。

Ⅶ 基因组序列解析举例

Ⅷ RNA测序

随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录

组分析新的重要手段，并且随着RNA的重要性逐渐被人所认识，研究人员也开发出多种方法来研究它。但是许多方法仍需将RNA反转录成cDNA，而这一步会引入错误，且效率不高。近期一些研究小组开发出了RNA测序新技术 常见的Illumina/Solexa测序技术（Solexa公司2007年被Illumina公司收购，因此现在通常被称为Illumina/Solexa测序技术）。

Illumina/Solexa新测序技术基本原理是边合成测序（sequencing by synthesis，SBS） ，即测序过程是以DNA单链为模板，在生成互补链时，利用带荧光标记的dNTP发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基，新加入dNTP的末端被可逆的保护基团封闭，既保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继续进行，为了增加荧光强度，使之更易被成像系统所采集，该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增（bridge amplification）。 GA（Genome Analyzer）、GAIIx、HiSeq 2000等测序仪，扩充了RNA测序的效率。其中GA（Genome Analyzer）采用的是边合成边测序技术和可逆中止化合物染料技术（Reversible Terminator Chemistry），提供高通量，高精确度，低成本的基因组测序。利用Illumina GA 测序技术在对基因组进行测序和注释的同时，也可对基因表达调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用展开研究。

GA测序方法可以在一个反应中同时加入四个标签，减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点。

需要掌握的内容： 测序的概念

DNA 一级结构的测定方法 Sanger双脱氧链终止法的原理 大规模测序的策略

对测序报告的简单解读方法

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高效毛细管电泳技术high performance capillary electrophoresis,HPCE（12周）

一、概述 电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对组分进行分离的技术称之为电泳技术。从20世纪30~40年代起，相继发展了多种基于抗对流介质的电泳技术(如纸电泳，凝胶电泳等)。传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。80年代初，细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术——毛细管电泳。 毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是以高压（可达30kV）产生的强电场

为驱动力，以石英毛细管（常用内径20~100μm，有效长度20~100cm）为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离的电泳。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。（带电粒子的电泳淌度：单位场强度下的稳定速度。）

毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 与传统的电泳相比，毛细管电泳的特点：一是高效，二是快速，三是微量，四是可以自动化，五是对环境污染小。在毛细管区带电泳中，柱效一般为每米几十万理论塔板，高的可达每米一百万以上，而在毛细管凝胶电泳中这一指标竟能达到几百万甚至上千万，通常的分析时间不超过30min，分析时用样量为几纳升。 与高效液相色谱（HPLC）相比，毛细管电泳具有操作简单，样品需要量少，分离效率高，速度快，并且运行成本低的优点。但是毛细管电

泳在迁移时间的重现性，进样准确性和检测灵敏度方面要逊色于HPLC，并且不利于制备性的分离。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶

液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，1948年，获诺贝尔化学奖。(电泳技术发展过程中划时代意义的工作) 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。(毛细管电泳发展史上的一个里程碑)

二、毛细管电泳仪 电泳仪：进样系统，分离系统，检测系统，数据处理系统 进样系统：静压力进样和电动进样；进样体积一般在纳升级；进样长度必须控制在毛细管总长度的1%~2%，否则将影响分离效率

分离系统： 毛细管：是CE分离的心脏。理想的毛细管必需是电绝缘、紫外/可见光透明和富有弹性的。目前可以使用的有塑料管、玻璃管、石英管等，其中弹性熔融石英毛细管已有大量商品出售，因而被普遍使用。由熔融石英拉制得到的毛细管很脆，易折断，但外涂聚酰亚胺后即变得富有弹性，这就是商品毛细管 温度控制：在电泳过程中，由于存在焦耳热效应，毛细管内会产生径向温度梯度，引起迁移速度分布不均，降低分离效率；另外气温的变化还会导致分离不重现。为解决这些问题，需将毛细管置于温度可调的恒温环境中。商品仪器大多有温度控制系统，主要采用风冷（强制空气对流）和液冷两种方式，其中液冷效果较好，但风冷控制系统的结构简单。

分离系统：毛细管：由熔融石英制成，内径通常为25~75μm，外径为350~400μm，有效长度为20~100cm。 恒温系统 ：控制柱温变化在±0.10C。 高压电源：电流0~300μA电压

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0~30KV，电压稳定性在±0.1%。 容积小（一根100cm×75 μm管子的容积仅4.4μl ）;

侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（ 100~ 1000V/cm）；

可使用自由溶液、凝胶等为支持介质； 在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。 主要优点：

高效：效率在105～106片/m之间，CGE效率可达107片/m以上。

快速：几十秒到十几分钟完成分离。

微量：进样所需要的体积可小到1? ，消耗体积在1～ 50nl间。

多模式：可根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器。

样品对象广：从无机离子到整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力。

经济：实验消耗不过几毫升缓冲溶液。

自动：CE是目前自动化程度最高的分离方法。 洁净：通常使用水溶液，对人对环境无害。 使用毛细管也给CE带来问题，比如： 制备能力差； 光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；

大的侧面/截面积比能“放大”吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰；

吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等。

检测系统：

常用的检测方式是紫外-可见光吸收。检测器位于距样品盘约毛细管总长的2/3~4/5处，对毛细管壁内部分进行光聚焦；

此外，荧光，激光诱导荧光，质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳。

检测窗口制作：聚酰亚胺涂层不透明，所以检测窗口部位的外涂层必需剥离除去，剥离长度通常控制在2~3mm之间。涂层剥离方法有硫酸腐蚀法、灼烧法、刀片刮除等。

硫酸腐蚀 将外涂层与浓硫酸接触、过夜，再用水、甲醇或丙酮顺次冲洗干净即成。

灼烧 直接用小火焰灼烧毛细管外涂层，完全碳化后，再用丙酮清洗。此法的缺点是灼烧宽度很难控制。将毛细管放在一根拉直的电热丝或烧红的铁丝上转动，就能控制灼烧宽度。灼烧法不适合于内有键合涂层或已填充的毛细管。

刮除 利用锋利的刀片如手术刀等可以将外涂层刮除。手动刮皮时，最好将欲刮除部位先涂黑，以便于定位和观察。实际操作前，建议先用一段废毛细管练习刮皮方法，待掌握要领后，再刮目标毛细管。本方法可自动化，适用于任何种类的毛细管。

三、基本原理

毛细管电泳分离的根据，是组分沿管轴方向运动的速度差异。和赛跑一样，混合物在迁移过程中，各种样品分子因自身的速度不同，将逐渐分成不同的方阵（区带），快者居前，慢者落后。时间或距离越长，方阵越小、数目越多、距离越开，即“分离”越好。如果我们在分离通道的“终点上”安装一种检测器，把分子通过终点的情况记录下来，就得到可供进一步分析用的图形信号，即电泳谱图。这一过程可用下图表示：

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。

1.经典电泳分离法的不足

所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。

2.高效毛细管电泳技术上的重要突破 两项重要改进：

一是采用了细内径的毛细管。 二是采用了高达数千伏的电压。

毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。

高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。

3.电泳现象与电渗流现象

电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度ν电泳

电渗流现象：熔融硅胶表面存在硅羟基, pH>3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流

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电渗是毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动。电渗起因于定域电荷。所谓定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。根据电中性要求，定域电荷将吸引溶液中的反号离子，使其聚集在自己的周围，形成所谓的双电层

电渗流的产生

a）石英表面负电荷 b）水合阳离子在表面附近聚积 c）场作用下指向负极的电渗流

?电渗的方向与固体表面电荷所具有的电泳方向相反；

?电渗的强度与定域离子的数量或固液界面成正比；

?毛细管内的电渗流为平头塞状，即流速在管截面方向上不变。

?在多数情况下，电渗流的速度是电泳流速度的5～7倍

4. 分离过程 电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出 阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。

5. 影响柱效的因素及改进方法

热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。 电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。

使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流；加入反转剂则可以改变电渗流的方

向。

四、分离模式

毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会。根据分离原理可分为: 毛细管区带电泳 CZE

毛细管胶束电动色谱 MEKC 毛细管凝胶电泳 CGE

毛细管等电聚焦电泳 CIEF 毛细管等速电泳 CITP 毛细管电色谱 CEC

毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis；CZE）

于操作简单，多样化，是目前CE中最基本，应用最广泛的一种方式，在CZE中，毛细管内只充入缓冲溶液，分离是基于样品中各个组分间荷质比的差异（即淌度的差异），由于中性物质的淌度差为零，所以不能以这种方式分离。有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用于提高分离选择性，改变电渗流的大小和方向，或抑制毛细管的吸附性等。

胶束电动毛细管色谱（ micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC ）

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如SDS），当其 浓度达到临界胶束浓度时，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下胶束在柱中移动。

2.电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流 > ν电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动； 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；

5.色谱与电泳分离模式的结合。

毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis ，CGE）

将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔 性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，是DAN排序的

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重要手段。

特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。

毛细管等电聚焦 （capillary isoelectric focusing，CIEF）

根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术。是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行，通过管壁涂层使电渗减到最小，以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚胶区带，再将样品与两性电解质混合进样。两端电极槽分别为酸和碱，加高压后，毛细管内部建立PH梯度，样品在毛细管中向各自等电点聚焦，形成明显的区带，最后改变检测器末端电极槽内的PH值，使聚焦的样品依次通过检测器而得以分离。

毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis, CITP) 采用非连续电解质溶液－前导电解质溶液和终结电解质溶液。并且所有组分按相同的电泳迁移速度依次流过检测窗口。前导电解质电泳迁移率高于样品中所有被分离离子的电泳迁移率，终结电解质的电泳迁移率则低于样品中所有被分离离子。 毛细管电色谱(capillary electro-chromatography ，CEC) 用微填充毛细管柱，以电渗流驱动流动相完成色谱分离过程。可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。

特点：

像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。 像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离；通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相明显地简化了输送体系。

电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。

毛细管电泳发展新动向

目前，国际上的毛细管研究侧重于应用，但

方法本身的完善和发展也同样热火朝天。应用研究的内容是多方面的，其中最富特色者有蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等。

方法发展同样也是多方面的，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。一般而言，新方法的发展研究难度大，而且可遇不可求，但近些年却有不小进展，比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳（ACE），芯片式毛细管电泳（CCE）等。 CCE是一种微型化的超速（秒级）电泳技术，其研究可能会进一步推开。 CAE的当前目标是实现高速DNA测序，已有8毛细管的CAE商品仪器推出，将来有可能出现能操纵上千根毛细管的CAE商品仪器。其实，CAE不仅仅适合于测序工作，也适合于其他大规模分析工作。

联用技术是解决毛细管电泳定性问题的最佳方法，在这方面，最令人兴奋的例子是CE-MS，它已可测定5-10个红细胞中的血红蛋白。此外，CE-NMR也已提出并实现。发展新的联用技术可能是CE研究中的重大方向之一。

分离条件选择策略 毛细管电泳模式的选定

毛细管电泳有许多不同的模式，因而在分离样品前必需很好选择分离模式，以达到最佳的分离结果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普适性、选择性、样品特异性等。

以简单性为原则时，所选分离模式的操作、条件优化、分离控制等必需是最简单和最容易的，而且富于后续变化。根据这一道理，首先应该考虑自由溶液分离模式，最后才考虑填充形式的分离模式（如图所示）。简单性原则是毛细管电泳模式选择的一般原则。

分离条件选择策略 毛细管电泳模式的选定

在分离生物样品时，通常需要根据分离的目的来选择分离模式：欲测定样品的尺寸，就须选NGCE或CGE，偶可选用CZE或MEKC；要测定样品的等电点，则应选用CIEF；在进行亲和作用研究时，则应当首先选用ACE。

我们的分析目的可能并不是单一的，这时的分离模式选择，就应该注意考虑其通用性。CZE、

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MEKC和CEC的通用性和可调节性都较大，但根据简单性原则，还以CZE或MEKC为优。注意，填充型毛细管电泳不适合于颗粒样品的分离，甚至也不适合于大分子分离。

分离条件选择策略

有时，我们会特别注重分离的选择性，即只希望把目标组份分离出来。此时应优先考虑选择性高的分离模式，如ACE等。如果已知样品的某些特性，也可以据此选择分离模式，比如在分离蛋白质和多肽等两性样品时，可以优先考虑CIEF；在分离中性分子时，优先考虑MEKC；在分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式等。

实际样品五花八门，性质各异，分离模式的选择是可变的和灵活的。这种灵活性恰好与毛细管电泳模式间的易换性相吻合 。

分离条件选择策略 基本操作条件选择 1、电泳电压

理论和实验均表明，效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，则极大电压可能会超出仪器的控制范围，此时没有最佳电压，可选用仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压有可能很小，若此时的分离度很高，也可以选择大于极大值的电压进行分离。

2、电泳温度

电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制旨在避免管内溶液因过热而出气泡或沸腾，显然温度越低越好；重现性控制意在避免温度波动；分离效率控制的目的在于提高分离度，依据样品性质的变化而高低不等，需由实验来测定。此外，某些介质对工作温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。

多数情况下，在20~30 ℃之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。如若不然，便需调整或优

化温度。优化多从室温开始，向上搜寻，若无结果，再向下搜寻。不少糖类样品需要同于室温的分离环境，有些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。

毛细管电泳温度的选择，目前还受到仪器条件的限制，大多数商品仪器只能在20~300C之间进行选择，而且不能实现温度梯度控制。此方面的研究还有待进一步展开。

3、毛细管及其洗涤 毛细管尺寸选择

毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用50或70μm内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40~60cm之间，但也有长达一米或短至数厘米者。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于300 μm的毛细管。当使用OT CEC时，毛细管内径又应小于20 μm，当然太细的管子检测过于困难。可在5~10μm之间选择。CGE或CEC的分离长度一般控制在20cm上下。CGE管的内径多为75 μm ，也可为50μm、100μm或更大；CEC管的内径可以大到320 μm。标准毛细管的外径是375μm，有些商品毛细管的外径是60、160或165μm。薄壁毛细管有利于温度控制。 涂层

根据分离模式和样品的不同，毛细管内壁性质要求也不同。在做大分子分离时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。在做CIEF或CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分离中，有时为了加强电渗或改变其方向，也需要涂层毛细管。 洗涤

毛细管的洗涤方式需视管内有无填充物和有无涂层来确定。空管通常用0.1~1N NaOH、水和缓冲液顺序冲洗1~5 min。如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子而欲除去，可用0.1~1N 的HNO3泡洗5~10 min，然后再用NaOH、水和缓冲液顺序冲洗。当使用相同缓冲液进行重复分离时，除非样品有吸附性，各分离之间只用缓冲液冲洗1~2 min便可。涂层毛细管通常采用中性或电泳缓冲液清洗，可以结合加热或络合等方法来提高清洗能力，换用有机溶剂由能清除脂溶性吸附组分。新的凝胶毛细管或其他固体物质填充的毛细管，应该用缓冲液在不进样条件下进行空白（正或反向）电泳，甚至电流和检测基线稳定后才可进行分离。后续各分离之间，填充管通常

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