微生物实验指导全文

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实验一显微镜的使用

微生物的个体很小，必须用放大倍数高的、结构精密的显微镜，才能了解其个体的形态特征及特殊的繁殖方式。因此，显微镜是学习微生物的重要工具，只有正确并熟练地掌握显微镜的使用方法，才能研究和观察微生物的形态。本实验通过观察细菌的染色涂片标本，重点练习和掌握油镜的使用方法。

一、器材准备

1、具油镜头的显微镜。

2、细菌染色涂片标本若干片。

3、香柏油、二甲苯和擦镜纸。

二、显微镜的构造

1、机械部分

显微镜的机械部分包括镜座、镜身、镜筒、载物台、物镜转换器、推进器、粗和细调螺旋等。

2、光学部分：

光学部分包括目镜、物镜、聚光镜、虹彩光圈、反光镜等。

三、显微镜的性能

显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能优劣，不只是视其放大倍数的高低，而更主要是视其辨晰细微结构的能力，即性能良好的显微镜必须使观察的物体放大倍数高，而且清晰。

显微镜辩析细微结构的能力可用分辨率表示。其能够辨晰的细微结构愈小，则分辨率愈高，分辨率的高低，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。若设物镜分辨出的物体两点间的最短距离为D ，则 D=2sin n 2A N 2α

λλ?=?=数值口径光波长度

D ——物镜分辨出物体两点间的最短距离。

λ——光波长度。

n ——介质折射率。

2sin α

——镜口角半数之正弦。

由上式可见，D值愈小，物镜的分辨率愈高，愈能分辨出物体的细微细构，物象愈清楚。根据上式看出，可通过减低波长、增大介质折射率和加大镜口角三方面来提高分辨率。对于普通光学显微镜，采用增大介质折射率来提高数值口径，是提高分辨率的可行途径。

四、显微镜的使用：

显微镜应直立实验台上，不要倾斜，因微生物学镜检过程中，常用水浸片和油浸片，如显微镜台倾斜，将导致水或香柏油流动，影响观察。

应将显微镜放正，把低倍物镜旋到镜筒下方，转动粗螺旋，使镜头与载物台距离约0.5cm，上升聚光器，使与载物台表面相距约1.0mm，左眼看着目镜调节反光镜角度，开闭光圈，使视野内得到最佳照明为止。

将细菌染色涂片标本置于载物台上，涂片部位放在正中，下降低倍物镜至标本约0.5cm处，观察目镜并调转细螺旋，以获得清晰的物像，再移动推进器，将所观察的部位置于视野中心。将低倍镜转成高倍物镜，再做进一步调整。

经过低倍和高倍物镜的初步观察就能转换成油镜正式观察。油镜放大倍数很高，其工作距离很短，一般只有0.19mm，应特别小心，以免损坏镜头和标本。在使用油镜时，标本上要滴一滴香柏油，再将镜头徐徐下降浸入香柏油中，直到几乎与标本相接触为止。左眼看着目镜，向上转调粗螺旋，观察到模糊标本物像后，改用细螺旋，至标本物象清晰为止。

a、干燥系物镜

b、油浸系物镜

图1 干燥系物镜与油浸系物镜光线通路

在使用油镜时加香柏油，是因香柏油的折光率是1.515，接近于玻璃1.52，大于空气的 1.0；由于介质的折光率相近，光线折射少，进入油镜的光线增多，物镜的分辨率提高。这样，就能看清检视物了。见图1

五、显微镜的保养：

油镜使用完后，必须用擦镜纸去擦镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少量二甲苯揩擦镜头，随后用一片擦镜纸将残余二甲苯擦净，否则粘固透镜的胶质会被二甲苯溶液溶解，日久镜片易移位脱落。物镜成“八”字形，紧靠载物台；聚光器放在最低处，反光镜直

立，用纱布擦干净各部位并把纱布盖上，放回木箱中。

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六、细菌形态的观察

按油镜的使用方法，每个同学自己动手找出一片染色涂片标本并绘图，其余的涂片，可互相观察或从示范片绘出。

七、回答问题

1．使用油镜时，为什么要加香柏油？能否用水或其它油代替？（附：一些物质的折光率）

香柏油1.515 甘油1.475 亚麻油1.47 冬青油1.536 玻璃1.52

石蜡油1.481 空气1.0 水1.33 松节油1.524 丁香油1.535 2．油镜使用完毕后应注意哪些问题？

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实验二微生物染色（一）

一、目的：

学习微生物的涂片染色的操作技术，掌握微生物的简单染色，革兰氏染色的基本原理和方法。

二、原理：

染色是细菌学中一个重要而且很基本的技术，由于微生物与各种不同性质的染料具有一定的亲合力，从而使微生物着色，着色后的菌体折光性弱，色差明显。在显微镜下容易观察细胞的内部结构及其内含物，因此，微生物染色是进行微生物形态观察的重要方法之一。染色分为单染（简单染色），复染（革兰氏染色，抗酸染色），单染较简单，以同一种染料使菌体着色，以显示微生物的形态；复染中的革兰氏染色是一种重要的鉴别染色，利用两种不同性质的染料，即草酸铵结晶紫和沙黄染液先后染色菌体，当用酒精脱色后，如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物的颜色，即呈紫色的细菌叫革兰氏阳性菌；如果草酸铵结晶紫与碘的复合物被酒精脱掉，菌体染上沙黄的颜色，呈红色叫做革兰氏阴性菌。

三、材料与用具：

（一）大肠杆菌（Escnerichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

普通变形杆菌（Proteus Vulgaris）

（二）染色：

1．简单染液：齐氏石碳酸复红染液，吕氏美兰染液

2．革兰氏染液。

（1）草酸铵结晶紫染液（染液）、

（2）路哥氏碘液（媒染剂）

（3）95%乙醇溶液（脱色剂）

（4）沙黄（蕃红）酒精溶液（复染剂）

（三）用具

显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、- 4 -

镜头纸、镊子、染色缸、火架、玻片架、烧杯等。

四、方法。

（一）制片

1．涂片：取保存在酒精溶液中的干净玻片，在酒精灯上烧去残酒精、待凉，用特种铅笔在玻片的右侧，注明菌名，色染类型，在玻片中央滴加一小滴无菌水，以无菌操作取少许菌苔，在玻片的水滴中涂布均匀，成一薄层。

2．风干：在空气中自然干燥，切勿在火焰上烘烤。

3．固定：将已干燥的涂片向上，在微火上迅速通过2—3次杀死细菌，凝固菌体蛋白，使得菌体与玻片结合牢固。

（二）染色

1．简单染色：在已制好的涂片菌膜处，滴加吕氏美兰染液染色3—5分钟。或滴加齐氏碳酸复红染液染色１—2分钟，以流水冲洗涂片，至水无色为止，后用滤纸吸干涂片的水滴，干后，待镜检。

2．革兰氏染色：

（1）在已制好的涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

（2）滴加路哥氏碘液媒染1分钟、水洗，用滤纸吸干残存水滴。

（3）斜置玻片于烧杯上端，滴加95%酒精脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出酒精刚刚不出现紫色时即停止，（约半分钟至1分钟），脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。

（4）滴加沙黄染液复染1分钟，水洗，滤纸吸干后，备镜检。

3．螺旋体染色：

（1）取清洁载玻片一张，在玻片中央滴加无菌水一滴。

（2）用无菌牙签取牙垢少许，涂于玻片水滴中，摊匀，风干，在火焰上通过二至三次以兹固定。

（3）滴石碳酸复红染液，染色三分钟，水洗，用滤纸吸干后，备镜检。

五、内容：

（一）用金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌制简单染色片，在油浸物镜下观察。

（二）用金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，普通变形杆菌，枯草芽孢杆菌制革兰氏染色片，在油浸物镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。

（三）用牙垢制螺旋体染色片，在油浸物镜下观察，注意螺旋体的形态。

六、报告：

（一）试述革兰氏染色的程序及染色原理。

（二）将本实验观察结果记录于表中。

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七、思考题：

（一）为什么细菌染色时所用的染料多属于碱性染料？为什么涂片需要固定？为什么制片干燥后才能用油镜观察？

（二）革兰氏染色过程中，哪些步骤是关键，为什么？

附：革兰氏染色谱

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实验三微生物染色（二）

一、目的：

了解微生物学中最常用的几种特殊染色及其在研究微生物形态分类中的重要性掌握芽孢，荚膜，鞭毛染色方法。

二、原理：

芽孢、荚膜、和鞭毛染色，都是利用细菌细胞不同的构造部分对染料的亲和力不同，用各种特殊染色法，使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。

三、材料与用具

材料：枯草芽孢杆菌（Baoillus Subtilis）

园褐固氮菌(Azotobacter Chroococcum)

普通变形杆菌(Proteus Vulgaris)

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoroscons)

醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

北京棒状杆菌A S 1. 299(Corynobacterium Pekinense)

染液：芽孢染液

5%孔雀石绿水溶液，0.5%沙黄（蕃红）水溶液

荚膜染液：

石碳酸复红染液

5%黑色水溶液（或用墨汁）

鞭毛染液

丹宁酸（鞣酸）

A液FeCl3

15%甲醛

1%NaoH

B液2%硝酸银溶液

用具：显微镜，载玻片，玻片架，滤纸接种环，无菌水，酒精灯，香柏油，二甲苯，火柴，擦镜纸等。

四、方法

芽孢染色法

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲合力不同的原理，用不同的染料进行

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着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，因此当先用一弱碱性染料孔雀石绿在加热条件进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（沙黄）进行复染色，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色。

染色步骤：

制片（方法同前）。

在玻片涂有菌苔处，滴加孔雀绿染液，使之充满玻片。

将玻片置于酒精灯高出火焰，徐徐加热，使染液在产生蒸气的情况下保持2分钟，随时滴加染料，切勿使染液煮沸或干涸。

待玻片冷却后，水洗（要求同前），吸干残水。

0.5％沙黄染液复染1分钟，水洗、吸干，备镜检。菌体红色，芽孢绿色。

荚膜染色

荚膜是包围在细菌细胞外面一层粘液性物质，其主要成份是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景染色而把不着色透明的荚膜衬托出来，荚膜很薄，易变形，因此制片时一般不用加热固定。

染色方法：有三种方法，可选作一种。

方法1：取少许菌苔与一滴石碳酸复红染色，在玻片上混合，染色约1分钟，然后加一滴黑色素水溶液或稀墨汁一滴，用另一块玻片，将菌、染料、墨汁推成一薄层，自然风干，备镜检，菌体红色，荚膜黑色。

方法2：取少许菌苔与一滴无菌水，在玻片上混合，摊平，待自然风干后，用石碳酸复红染2－3分钟，水洗（注意水不要直接冲洗涂菌处），用滤纸吸干，在玻片一端加墨汁一滴，然后用另一块玻片，将墨汁推成一薄层，自然风干。备镜检，菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

方法3：取少许菌苔与一滴无菌水，在玻片上混合，摊平，待自然风干后，用草酸铵结晶紫染色30秒钟左右，水洗（注意水不要直接冲洗涂菌处）用滤纸吸干，备镜检，菌体紫色，荚膜无色。

鞭毛染色法

细菌的鞭毛极为纤细，直径在0.1微米( m)以下，因此在普通光学显微镜下不能见到，只有用特殊的染色方法才能把鞭毛显示出来，鞭毛的染色方法很多，但主要的原理都是采用不稳定的胶体溶液作媒染剂，在鞭毛上生成沉淀，加大鞭毛的直径，然后再进行染色。同时，培养稍久的菌，鞭毛易脱落，所以要用新鲜的菌体，一般是用经3－5代（每代培养时间16－20小时）最后一代接到含0.8—1.2%琼脂的软洋菜培养基(带有冷凝水)经12－16小时培养的菌体为佳。

染色步骤

Ⅰ、制片：

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从酒精溶液保存的玻片缸中用镊子取出一张玻片，在火焰上烧去残存的酒精视玻片无水迹，光滑即可用，注明菌名。

从已移接3—5代带有冷凝水的斜面菌种的冷凝水处，以无菌操作，用接种环取一环菌液。

3．将底玻片倾斜，在带有菌液的菌环上滴下一滴无菌水让水从玻片上端自然流向下端，切勿用接种环涂抹，以免损伤鞭毛。

4．自然风干。

II、染色方法

1．Ａ染液3—5分钟，用蒸馏水冲洗净Ａ液，（注意：一定要充分洗净Ａ液后再加Ｂ液，否则背景很脏）。再用Ｂ液冲洗残水，使Ｂ液充满玻片，在火焰上轻轻加热至冒气后，维持30—60秒，然后用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，备镜检，菌体为黑褐色，鞭毛为深褐色。

2．鞭毛染色也可采用不加热的方法，但染色时间要长些，一般Ａ液染6—7分钟，Ｂ液染5分钟，镜检菌体及鞭毛都呈褐色。

五、内容：

（一）用枯草芽孢杆菌进行芽孢染色，置油浸物镜下观察。

（二）用园褐固氮菌进行荚膜染色，置油浸物镜下观察。

（三）用普通变形杆菌和萤光假单胞菌进行鞭毛染色，置油浸物镜下观察，注意鞭毛的着生位置。

选作内容：

（一）制醋酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢染色片，置油浸物镜下观察，注意芽孢的位置。

（二）制枯草芽孢杆菌的细胞壁染色片，油浸物镜观察细胞壁呈深紫色，细胞质呈淡紫色，（常规制片，5％鞣酸染5分钟，水洗，0.2％结晶紫染3—5分钟）。

（三）北京棒状杆菌Ａs1.299异染粒的染色片，油镜观察，菌体呈淡兰色，异染粒呈深兰色．（常规制片，甲液染5分钟，倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1分钟，水洗）。

甲液：甲苯胺兰（Toluidine blue）0.15克

孔雀石绿（Malacnite green）0.20克

冰醋酸１毫升

酒精（95%）2毫升

蒸馏水100毫升

乙液：碘（I）2克

碘化钾（KI）3克

蒸馏水300毫升

（四）苏云金杆菌的伴孢晶体染色片，油镜观察晶体呈红色菱形状，游离的芽孢为红色圈状。

（染色液为1／10的石碳酸复红染液）

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（五）巨大芽孢杆菌的聚Ｂ－羟基丁酸（Poly-β-hydroxybutyrio acid）

染色片，油镜观察，菌体红色，聚β－羟基丁酸为兰黑色（常规制片，苏丹黑染10分钟，水洗，吸干残水，二甲苯洗脱色素，０.5％蕃红复染1—2分钟）０.3％的苏丹黑染液。

苏丹黑B(Sudan blaekB)0.3克

乙醇(70%) 100毫升

混合后，用力振荡,过夜备用。

六、报告：

（一）绘图表示芽孢，荚膜和鞭毛。

（二）将本次实验观察结果记录在下表：

七、思考题：

1．芽孢、荚膜、鞭毛染色为什么称为特殊染色？

2．鞭毛染色与其他染色有何不同？为什么？

附：鞭毛染色所用载玻片的清洗：

选择光滑无伤痕的玻片，先用洗衣粉煮沸，洗衣粉最好在洗玻片前加蒸馏水煮沸，用滤纸过滤去渣，为了避免玻片彼此磨损，最好把载玻片放在特制的架上煮，煮后稍冷却后取出，用清水洗净，再放入浓洗液中浸泡24小时左右，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净，沥干水并放入95%乙醇中脱水，取出玻片，用火烧去酒精，立即使用，在洗净的玻片上滴上水滴后应能均匀散开。

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实验四真菌的形态

一、目的：

掌握真菌的形态和结构：学习小室培养的方法：检测环境中微生物的数量和种类

二、原理：

带有培养基的小空间可以造成真菌适宜的生长环境。这样培养的微生物可以保持菌体完整的形态和结构。便于观察和研究在自然界和人体存在的各种微生物。用适宜的培养基可以检测出它们的存在。

三、村料和用具

（一）材料：毛霉（Mucor mucedo）

黑根霉（Rhizopus negricans）

黑曲霉(Aspergillus SP)

产黄青霉（Penicillium Chrysogenum）

细黄链霉（Streptomyces microflarum）

啤酒酵母（Saccnaromyces cerevi iae）

（二）用具：培养皿“U”形玻璃棒

四、方法

（一）小室培养：

在进行放线菌和各种霉菌的形态观察时，可以采用压滴法制片（见实验一）但制片时，菌体的各部分结构往往被破坏。不宜观察到完整典型的形态。采用小室培养可以清晰地观察到菌体的完整结构，方法如下：

1．准备好清洁无菌的器皿：包括培养皿“U”形玻璃棒载玻片、盖玻片、滤纸。

2．预先在一套无菌培养皿内倒入已灭菌的固体培养基（培养基组分视所培养的微生物而定。但浓度比原配方稀三分之一。）成一厚约3—4mm的薄层。待冷凝后，用无菌小刀切成10×10mm2的小块。

3．用无菌镊子取一小块固体培养基，置于载玻片上，用接种环在培养基四周接上霉菌孢子盖上盖玻片。

4．在培养皿内放入园形滤纸，滴加无菌20%甘油3—4ml。

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5．在滤纸上放入“U”形玻璃棒，将制好的玻片置于玻棒上盖上培养皿盖（图2），温箱中培养，注意全部操作必须严格无菌，菌体生长后，取出玻片置显微镜下观察。此法最适合进行放线菌的基内菌丝，气生菌丝孢子丝，霉菌的分生孢子梗，分生孢子，孢子囊柄等的观察。

培养皿

“U”形玻棒

载玻片

培养基

盖玻片

滤纸

侧面观

图2 小室培养

（二）根霉接合孢子

取黑根霉（Rnizopus nigricens）+3.2045－与黑根霉（Rnizopus nigrleens）－3.2046分别划线接种于马铃薯培养基平板两侧于30℃温箱培养4—7天在平板中线附近挑取少许菌丝制成压滴片。可观察到配子囊和接合孢子。

（三）根霉的假根

根霉的气生菌丝遇到基质以外的障碍（如玻璃壁）可分化假根。

在麦芽汁固体培养基或查氏固体培养基（以葡萄糖代替庶糖）平板上点接黑根霉（Rhizopus nigricans）孢子每皿可点接6—10处，在28℃温箱倒置（皿底向上见图3）培养2—7天，或者在皿盖上放一张无菌玻片。用“U”形玻棒架高，制片时间可缩短。在低倍镜或高倍镜下，观察皿盖或玻片可见到假根，孢子囊梗，孢子囊等结构。

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培养基

根霉

载玻片

玻璃棒

图3 假根培养

（四）酵母菌子囊及子囊孢子的形成和观察

1、将啤酒酵母（saccharomyces cerevisiac）接入麦芽汁斜面，25℃—30℃温箱培养24小时。然后移入麦芽汁液体培养基25℃—30℃温箱培养24小时。

2、取上述液体培养物1毫升移入新的麦芽汁液体培养基中。25—30℃培养24小时，离心（3000rpm）5—10分钟，弃上清液用3—5毫升生理盐水洗涤两次（除去附着在细胞外围的营养）。

3、取上述酵母泥涂于生孢子培养基上（斜面）25—30℃培养4—6天。

4、制片可观察到子囊及子囊孢子（可用孔雀石绿及复红染色。子囊红色，子囊孢子绿色）

附：培养基配方：(培养酵母用)

（1）10Brix麦芽汁（固体斜面加1.5%琼脂）

（2）生孢子培养基

NaAC 0.82克或NaAC3H2O 1.36克

Kcl 0.186克

微量元素溶液0.1毫升

琼脂2克

水100毫升

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微量元素溶液

KI 10mg

Na2B4O710H2O 8.8mg

Mncl24H2O 3.6 mg

ZnSO47H2O 30.8 mg

C U SO45H2O 3.9 mg

(NH4)6MO7O244H2O 1.9 mg

Fe2(SO4)36H2O 22.8 mg

水100 mg

加入1NHCL到不再混浊为止。

（五）微生物的检测

用教师发给的营养琼脂培养基平板（如牛肉膏蛋白胨固体培养基马铃薯培养基等）其中一只平板打开皿盖在空气中暴露三十分钟，另一只平板，打开皿盖用揩过桌面的无菌棉签，在培养基表面划线：用自已的手指触摸第三只培养基平板的表面。

五、内容

1．按教师指定的菌种制小室培养片，培养后观察。

2．接种黑根接合孢子平板一只，培养后制片观察配子和接合孢子。

3．培养根霉的假根，并观察。

4．培养啤酒酵母使之生长子囊和子囊孢子并制片在高倍镜下观察。

5．用三只固体营养琼脂平板进行微生物的检测，肉眼观察菌落的形状、大小、色泽、透明度，并区分细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。

6．观察示范片

a 假丝酵母的假菌丝（以热带假丝酵母candidatropicalls为村料）

b 毛霉（Mucor mucedo）黄曲霉（Aspergillussp）青霉（penicillium sp）的标本片。

c 霉菌菌落平板，注意毛霉、根霉、曲霉、青霉和菌落特征。

六、报告

（一）绘制你所培养的小室培养的微生物的形态并注明各结构的名称。

（二）绘图表示黑根霉的接合孢子和啤酒酵母的子囊和子囊孢子。

七、思考题

（一）列表表示毛霉、根霉、曲霉、青霉细胞形态结构的异同。

（二）复习总结实验一至实验四的方法和内容。

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实验五微生物细胞大小的测定

（一）利用台尺、目尺测定微生物细胞的大小

一、目的要求

了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理；掌握微生物细胞大小的测定方法。

二、基本原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用来测量细胞大小的工具有目镜测微尺（简称目尺）和镜台测微尺（简称台尺）。

目镜测微尺是一块园形玻片，在玻片中央把5mm 长度刻成50等分（图4）或把10mm 长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来

测量经显微镜放大后的细胞物象，由于在显微镜不同的接目

镜和接物镜系统下，放大倍数不同，目镜测微尺每格所示长

度随显微镜放大倍数而变化，所以在使用前，须用镜台测微

尺来校正，求出在显微镜某一接目镜和接物镜系统下，目镜

测微尺一格的长度。

镜台测微尺形如载玻片，在中央的园形盖片下，有一条

长为1mm 的刻度，精确等分为100格，每格长10μm 。故

用已知长度的台尺校正目尺，即可求出目尺一格的长度。

图5 镜台测微尺

A.镜台测微尺

B.放大的尺子

图4 目镜测微尺

- 16 - 三、实验材料

1．菌种巨大芽孢杆菌或杀螟杆菌染色片；酵母菌水浸片。

2．器材目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，双层瓶，擦镜纸。

四、实验步骤

（一）目尺校正

1．将目镜测微尺小心地装入接目镜的隔板上，使刻度向下，把镜台测微尺置于载物台上，使刻度向上，用弹簧夹夹稳。

2．先用低倍镜观察，调节工作距离，从视野中看清镜台测微尺的刻度后，移动推动器并转动目镜，使目镜测微尺的刻度和镜台测微尺的刻度平行。

3．用推动器定位，使两尺重叠，先使两尺一端的“0”刻度完全重合，再寻找两尺另一端的重合刻度，以两端的重合刻度线相距愈远愈好。

4．数出两重合刻度间目镜测微尺的格数（N ）和镜台测微尺的格数（N 1）。已知台尺每格长度是10μm ，故目尺每格之长度X 即可求得： X=两重合线间目尺格数

两重合线间台尺格数10N 10N 1?=? 5．先在低倍镜下校正后，随即用推动器把台尺的刻度移到视野正中央，然后更换高倍镜。

6．同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每格代表的长度。

7．校正完毕，取下镜台测微尺，用一张擦镜纸蘸酒精乙醚液少许，擦去油污，再以另一张干净的擦镜纸轻轻擦去残留的酒精乙醚液，然后装入盒内，妥为保存。

（二）细胞大小的测定

1．将细菌染色片或酵母菌水浸片，置于载物台上，用低倍镜和高倍镜找到目的物，把菌体分散均匀的部位移到视野中心。

2．在高倍镜下，测量酵母菌细胞的大小。在油镜下，测量细菌细胞的大小。先量出菌体长和宽或直径占有目镜测微尺的格数，再用校正的目镜测微尺每格长度，计算出菌体长度和宽度，计量单位以微米（μm ）表示。同一涂片上，任意测定10～20个菌细胞，求其平均值，即可代表该菌的大小。

五、实验报告

将实验结果记录于表1，表2中。

表1 台尺校正目尺结果

物镜

目尺格数台尺格数目尺校正值（μm/格） 10×

40×

100×

表2 细菌大小测定记录菌名

细胞数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ∑平均长

宽

结果计算长μm=长平均格数×校正值

宽μm=宽平均格数×校正值

大小表示宽μm×长μm

六、思考题

1．为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺校正？

2．在目镜放大倍数固定情况下，改变接物镜，由低倍、高倍到油镜，为什么测出目尺每格之长度愈来愈小。

（二）利用数码显微镜的Motic Images Advanced3.2软件自动测量

有数码显微镜的可利用的安装的Motic Images Advanced3.2软件，进行测量。把所需测量的细胞标本片放置在数码显微镜下后，选择所需物镜，调节粗、细螺旋至清晰物象后，进行微生物细胞大小的自动测量，打开桌面的Motic Images Advanced3.2软件图标后，在工具栏中打开采集窗口，设置放大倍数与所观察的放大倍数一致，调节基本选项卡中的曝光时间、增益、偏移至视觉合适程度，单击捕捉按钮，根据需要可在捕捉设置中选择捕捉全图、捕捉区域图，一般选用捕捉区域图，单击该选项后，在界面上选定清晰的图像，按住鼠标左键拖动，单击下方的捕捉图像按钮，这时所捕捉的图像出现在右侧的列表中，最小化原界面后，单击右侧所捕捉的图像“Capture.sfc”，捕捉图像即放大显示，单击处理菜单的分割选项，可选用自动单色分割、自动双色分割，分割处理后，可选用处理菜单中的自动计算或利用测量菜单中的工具进行手动测量，记录显示结果。

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实验六显微镜下直接测数法—血球计数板法

一、目的要求

了解血球计数板的构造、原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。

二、基本原理

血球计数板测数，一般适用于含菌体较大的单细胞的悬浮液，如酵母菌、霉菌孢子等，若有杂菌或杂质，则较难辨认。对个体小的细菌也不易辨清，必要时，可采用彼德罗夫一霍瑟（petroff —Hausser ）细菌计数板，即可在油镜下计数。

血球计数板的构造和使用原理：（图

6）。

血球计数板为一特制的厚型载玻片，

在其中部有三条玻璃台（a,b,a 1），b 台上

刻有一对每边长1mm 的大方格，大方格

各边分为20等分，因此1mm 2的大方格，

等分为400个小方格（图7）。a,a 1台比b

台高出0.1mm ，所以加盖玻片后，从盖玻

片到b 台台面之高度（即液层深度）也是

0.1mm ，由以上数据可得出：

大方格面积=1mm ×1mm=1mm 2

大方格体积=1mm 2×0.1mm=0.1mm 3

一个小方格体积=4000

1mm 4001.03= mm 3

已知：1m1体积=10mm ×10mm ×10mm=1000mm 3

所以，1m1体积中应含有小方格数=3

mm 4000

1mm 1000 =1000×4000

=4×106个小方格

即系数K=4×106

因此，每m1菌悬液中含有细胞数=K ×d ×-N

K ：4×106

图6 血球计数板 A.平面图 B.断面图 1.中央平台 2.盖玻片

- 19 - d ：菌液稀释倍数

N ：一个小方格中细胞平均数。由上可知，用血球计数板在显微镜下直接测数时，首先数出一个小方格（

3mm 4000

1）均质菌液中的细胞数，然后根据公式求得1m1菌液中的细胞数。三、实验材料

1．测试样品酵母菌液或细菌悬液。

2．器材血球计数板，盖玻片（22mm ×22mm ），

无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，显微镜等。

四、实验步骤

1．准备工作

（1）取血球计数板一个，用无菌滴管吸取摇匀的

菌悬液少许，滴在b 玻璃台网格上，不要使a ，a 1玻璃

台沾上菌液，以免加盖玻片后，造成b 台上液层深度的误差。

（2）取干净的盖玻片一张，盖在a ，a 1玻璃台上，勿使产生气泡，使多余的菌液流入a ，b 和a 1，b 玻璃台间之液槽内，静置数分钟，使菌细胞沉积于平面上。

2．镜检测数

（1）将血球计数板置载物台上夹稳，先用低倍镜找到方格位置，再用高倍镜测数，由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光的亮度。

（2）在高倍镜下，观察五个视野，每个视野任意计数五个小方格内之细胞数。位于小方格四边的压线细胞，只计两边，另两边不计；对于出芽的酵母，以芽体与细胞接近大小时，按二个菌体计数。然后求出一个小方格的细胞平均数（-N ）。在观察时，应充分运用微动螺旋，以便观察到处于不同液层的细胞，以减少误差。

（3）测数完毕，取下盖玻片，用清水把血球计数板冲洗干净，用吸水纸轻轻吸去台上附着的水分，再用擦镜纸小心地吸干．．．．．

计数板，注意勿使网格受到磨损，然后放入盒内保存。

3．计算

将-

N 值代入公式，求出每m1（g ）菌液中的细胞数。五、实验报告

计算并报告所测样品每m1（g ）的含菌数。

六、思考题

1．系数K 值是如何求得的？

2．血球计数板的显微镜直接测数法有何优缺点？

图7 b 台网格放大图

实验七培养基的制备与灭菌

一、目的：

学会一般培养基的制备原理、方法、掌握培养基及器皿的灭菌方法。

二、原理：

培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐外，还需要各种必要的维生素，以提供能源，组成菌体细胞的原料及调节代谢活动，由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同。因此，需提供不同种类的培养基，一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基。

培养基除了要满足微生物所要求的各种营养条件外还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度、渗透压等。因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH范围。如：细菌、放线菌培养基偏碱、霉菌、酵母菌培养基偏酸。

根据研究的不同，可以将培养基制成固体半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入1.5-2.0%的琼脂。半固体加入0.3-0.5%琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶。

三、材料与用具

（一）材料：马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、NaCI、KNO3、K2HPO4、、MgSO47H2O、FeSO47H2O、NaOH、HCI

（二）用具：试管、锥形瓶、漏斗、量筒、移液管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、PH试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、防潮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、（比色盘）铁丝筐。

四、方法

（一）培养基的制作方法

1．称量：按照培养基的配方，准确称取各成份于烧杯中。

2．溶化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅动，然后加热使其溶解，用豆芽或土豆等配制的培养基，须先将豆芽或土豆按其配方的浓度和加热煮沸半小时（土豆须先削皮）并用纱布过滤，然后加入其它各成份继续加热使其溶化，补足水分，如果配方中含有有淀粉，则需先将淀粉及其他药品加热溶化并补足水分。

3．调节pH值：初制备好之培养基往往不能符合所要求的pH值，故需要酸度计，- 20 -

pH试纸或用氢离子浓度比色计来矫正，用0.1N NaOH或1NHCI调至合适的范围。

4．过滤：用滤纸或双层纱布（中间夹一层脱脂棉花）趁热过滤。