实验设计

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药理实验设计（三号黑体）

姓名班级学号（五号宋体）

1.实验项目名称

2.国内外研究现状（实验原理） 3.研究开发意义（实验目的意义） 4.实验研究的主要内容及创新点 5.实验方法和技术路线 6.参考文献

（正文部分：宋体小四号；行间距：固定值

20磅）

1.项目名称：海洋生物活性物质对急性心肌缺血保护作用的实验研究 2.研究工作对浙江经济、社会和科技发展的意义

目前，缺血性心脏病是一类严重危害人类健康的常见病，包括心绞痛、心肌梗死、原发性心脏骤停、缺血性心肌病、心律失常等。心肌缺血是指由于各种原因引起心肌耗氧量和冠状动脉供血、供氧量之间平衡失调，出现心肌供血不足而导致心肌损害。上述疾病的冠状动脉病变部位、梗塞程度、血管受累情况、侧枝循环以及血管痉挛等临床表现虽然复杂多样，病理生理特点差异很大，但是都有着心肌细胞缺血缺氧这一共同点。

临床上现有的抗心肌缺血药物主要包括硝酸酯类、β受体阻断剂、钙拮抗剂及复方中药制剂等，然而这些药物都存在一定的局限性和不良反应，导致治疗效果不是非常理想。近年来，随着急诊溶栓和经皮冠状动脉成形术的逐渐推广应用，及时恢复血流再灌注成为治疗缺血性心脏病普遍采用的措施。然而，国内外大量研究表明，缺血再灌注将加重心肌缺血所引起的一系列损伤，包括再灌注心律失常、心肌收缩与舒张功能障碍、心肌细胞坏死及内皮损伤等[1]。因此，如何防治心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury；MIRI)是缺血性心脏病治疗的关键。

MIRI的机制非常复杂，尚未完全阐明，目前认为与氧自由基生成增多、细胞内钙超载等有关。Zhao等[2]于2003年正式提出了缺血后处理的概念。现有研究表明[3]，采用药物干预能减轻再灌注损伤，如肾素-血管紧张素抑制剂、钙通道阻滞剂及中草药制剂等，可减小心肌缺血面积，对心肌重构具有一定的保护意义。但临床现有治疗心肌梗死的药物多是单一靶向性药物，选择性较高。因此，开发新型药物，对心肌梗死病理过程的多个环节均能发挥一定的保护作用，对缺血性心脏病的治疗应该具有重要的意义和较广阔的前景。

目前，组合化学与高通量药物筛选技术的结合为快速发现有新药开发潜力的先导化合物开辟了新的研究途径。但是从天然资源中寻找具有显著生物活性的天然产物仍然是发现新药先导化合物的主要途径。在天然药物资源中,海洋生物资源是保留最完整,来源最丰富,最具新药开发潜力的领域。由于海洋生态环境的特殊性(高盐度,高压,缺氧,避光) ,使得海洋生物产生的次生代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地生物相比有着巨大的差异,导致海洋生物往往能够产生

一些化学结构新颖、生物活性多样、显著的海洋药物先导化合物,为新药研究与开发提供了大量的模式结构和药物前体。海洋生物资源是一个巨大的、潜在的、未来新药来源的宝库已成为一种共识。

20世纪90年代,许多沿海国家都把开发利用海洋作为基本国策。美、日、英、法、俄等国家分别推出包括开发生命活性物质和海洋药物在内的“海洋生物技术计划”、“海洋蓝宝石计划”、“海洋生物开发计划”等,投入巨资发展海洋药物及海洋生物技术,世界上一些著名的大学也相继建立海洋药物研究机构。

在过去的几十年间,全世界范围内已从海洋动植物及微生物中分离得到的新型化合物有15000多种。这些已发现的化合物,不仅包括了陆地生物中已存在的各种化学结构类型,并且还发现了很多海洋生物独有的特殊结构类型。一些海洋来源的先导化合物已成功地开发成药物,包括来源于海洋真菌的抗感染药物头孢霉素(cephalosporins)、来源于海绵的抗肿瘤药物阿糖胞苷(cytarabine, AraC)和抗病毒药物阿糖腺苷(vidarabine, AraA)等。

我国海域辽阔,海洋生物资源丰富。据初步统计,我国海洋生物经分类鉴定的有2万多种,其中,仅我国近海发现的具有药用价值的海洋生物就有700 多种。许多具有免疫、抗炎、抗肿瘤、抗病毒以及作用于心血管系统和神经系统的生物活性物质先后被分离、提纯,其中部分先导化合物已进入临床前研究,一些海洋新药已进入临床研究[4-5]。

对具有抗心血管疾病活性化合物的研究是海洋天然产物研究的一大重点。目前已对数千种海洋生物的代谢产物进行了活性筛选,发现一批具有显著活性的化合物,其化学结构类型包括萜类、多糖类、高级不饱和脂肪酸类、喹啉酮类、生物碱类、肽类和核苷类等。但目前进入临床应用的抗心血管海洋药物仍然较少,主要有来源于藻类的多糖药物藻酸双酯钠、甘糖酯和烟酸甘露醇以及多烯康等。

舟山群岛素以“渔盐之利、舟楫之便”而扬名于世。2.08万平方公里的辽阔海域有明暗礁3350个，海岸线长达2355公里。众多的港湾岛屿，大量的滩涂礁石，优越的地理位臵，蕴藏着极其丰富的海洋生物资源。各种海洋活性物质也分布于各门类的生物体中，有待开发利用。若能从中开发出新型的抗心肌缺血药物，必将为缺血性心脏病的治疗带来福音。

本项目拟就舟山群岛海域常见藻类和贝类海洋生物的抗心肌缺血药理活性

进行初步研究，以期发现对急性心肌缺血具有较好保护作用的海洋生物活性物质，用以进行后续开发。

3.项目研究内容、研究方案和进度安排 3.1 研究内容

①采集舟山群岛海域常见藻类和贝类海洋生物如贻贝、牡蛎、毛蚶、紫菜、海带、海苔等，运用一定的提取方法制备多种提取物。

②采用实验动物（家兔）结扎左冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死模型，同时分别应用上述提取物进行治疗，多时间点检测心电图；计算心肌梗死面积；测定血清磷酸肌酸激酶（CPK）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；TUNEL法检测心肌细胞凋亡。

③将上述经筛选获得的对急性心肌缺血具有一定保护作用的海洋生物的粗提物进行分离提纯，并作初步的成分分析和结构鉴定。 3.2 研究方法

①粗提物的制备：采集舟山群岛海域常见藻类和贝类海洋生物如贻贝、牡蛎、毛蚶、紫菜、海带、海苔等，选择不同的溶剂如蒸馏水、乙醇、乙醚等，运用一定的提取方法如超声提取、微波提取等，制备多种提取物。

②将家兔随机分成下列各组：假手术组(sham)：左冠状动脉前降支只穿线不结扎静脉滴注生理盐水；梗死模型组(MIRI)：左冠状动脉前降支结扎30min，再灌注60min，结扎前静脉滴注生理盐水；试验药物组：左冠状动脉前降支结扎前，持续15 min静脉滴注上述各种提取物，结扎30min，再灌注60min；阳性对照药生脉注射液组(SMI)：方法同试验药物组[6-7]。

③在体兔MIRI模型的制备：家兔称重后以3%戊巴比妥钠35mg.kg-1耳缘静脉注射麻醉，仰卧固定，常规记录肢体Ⅱ导联。于左侧第3、4肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，分离左冠状动脉前降支，除假手术组只分离冠脉不结扎外，其他各组均结扎30min，再灌注60min。

④心电图检测：连接肢体Ⅱ导联，在结扎前、缺血15及30min、再灌注15、30及60min等时间点观察心电图T波及Q波的变化。

⑤测定血清CPK、AST、LDH、SOD和MDA的含量[7-8]：于再灌注60min时自股

静脉取血，采用全自动生化分析仪测定血清中CPK、AST、LDH、SOD和MDA的含量。

⑥心肌梗死面积测定：各组分别于再灌注60min后处死动物，摘取心脏，分离左心室，将左心室均匀切成0.2cm薄片，臵pH7.4，1%TTC溶液中，于37℃水浴孵化15min，梗死区呈白色，未梗死区因含有完整的脱氢酶而染成红色。测量每片心肌双侧的梗死区与非梗死区，计算每片心肌的面积、心室总面积和梗死区总面积，计算梗死区占左心室及全心的百分比[9-10]。

⑦TUNEL法检测心肌细胞凋亡：再灌注60min末，迅速摘取心脏并洗净，4%多聚甲醛灌流2h至心脏发白，取靠近心尖部分心肌组织臵于10%福尔马林中固定24h，常规石蜡包埋，切片，进行TUNEL染色。光镜下随机选取高倍视野，测定凋亡心肌细胞数及心肌细胞总数，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数[11]。

⑧将上述经筛选获得的对急性心肌缺血具有一定保护作用的海洋生物的粗提物进行分离提纯，并作初步的结构鉴定。 3.3 技术路线

①粗提物的制备：

水提取

海洋生物采集清洗后浸泡片刻乙醇提取各种粗提物乙醚提取

②药理实验部分：

假手术组梗死模型组

家兔随机分组试验药物组麻醉连接肢体Ⅱ导联阳性对照药

暴露心脏分离左冠状动脉前降支分别持续15 min静脉滴注上述各种提取物、生理盐水或生脉注射液结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注60min 检测各时间点的心电图T波及Q波的变化情况

③生化检测：

再灌注60min时各组家兔分别自股静脉取血离心分离血清采用全自动生化分析仪测定血清CPK、AST、LDH、SOD和MDA含量 ④心肌梗死面积测定：

再灌注60min后处死动物分离左心室均匀切成薄片臵pH7.4，1%TTC溶液中，于37℃水浴孵化15min 测量每片心肌双侧的梗死区与非梗死区面积 ⑤TUNEL法检测心肌细胞凋亡：

再灌注60min末摘取心脏 4%多聚甲醛灌流2h 取靠近心尖部分心肌组织臵于10%福尔马林中固定24h 石蜡包埋，切片 TUNEL染色光镜高倍观察测定凋亡心肌细胞数及心肌细胞总数 ⑥粗提物活性成分分析：