HPLC Method development

液相色谱方法的建立

高丽萍 June 4,20111

目 录1.HPLC方法建立过程中的常见问题 方法建立过程中的常见问题 1. 2.HPLC建立的一般程序 建立的一般程序 2. 3.色谱条件的建立 3.色谱条件的建立3.1 色谱柱的选择 A.色谱柱的归类 A.色谱柱的归类 B.C18色谱柱的性能影响因素 B.C18色谱柱的性能影响因素 C.固定相种类的选择 C.固定相种类的选择 3.2 流动相的选择 A.流动相中的酸 A.流动相中的酸 B.流动相PH值与样品保留时间的关系 流动相PH B.流动相PH值与样品保留时间的关系 C.流动相中的缓冲盐 C.流动相中的缓冲盐 D.流动相中的离子对试剂 D.流动相中的离子对试剂 E.流动相中的其他组分 E.流动相中的其他组分

一、HPLC方法建立过程中的常见问题 HPLC方法建立过程中的常见问题对HPLC方法的所要达到的目标不明确 (如可能检测到多少个杂质，检测到什么水平) 对杂质的相关工作太粗 (杂质的ID,响应因子，杂质是否会在体系中进一步降解等) 方法建立时选择的样品不合适 (如选择了精制后的样品) 没有注意样品的处理方法 (如超声/在溶剂中的降解过程/进入色谱柱后发生水解等) 没有考虑色谱柱能否长期满足系统适应性的要求 (同一色谱柱的耐用性，不同色谱柱的等同性等) 方法建立之前，没有进行产品的降解实验3

二、HPLC 建立的一般程序合成人员： 合成人员： 介绍产品的合成路线/产品的性质(如产品的酸碱性、稳定性等) 推断产品相关杂质的结构和极性等 合成或分离得到相关杂质

分析人员： 分析人员： 参考文献(如chromatography,bio-pharmaceutical analysis) 选择色谱柱/选择流动相/选择合适的检测器和参数 LC-MS确认杂质的数量 条件优化(流动相种类，比例等) 项目的专属性 方法验证4

循环

三、色谱条件的建立

样品结构特征 样品种类 样品的溶解度及稳定性 样品信息 含有的杂质数目和性质 样品的PKa值

色谱条件优化 的依据分析时间 分离度 理论塔板数 拖尾因子 灵敏度 合理的系统适应性指标具有非常重要的意义。5

分离目标

3.1色谱柱的选择 3.1色谱柱的选择A.色谱柱的归类 A.色谱柱的归类低极性 非离子 中高极性 Mw<2000 阴离子 离子 反相HPLC 阴离子交换、离子排斥、 离子对 阳离子交换、离子对 正相HPLC

样 品阳离子

水溶性 Mw >2000 脂溶性

凝胶过滤色谱 凝胶渗透色谱

B. C18色谱柱的性能影响因素 色谱柱的性能影响因素 硅胶纯度--- 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 硅胶纯度

物 理 性 质

色谱柱尺寸--- 填料床的长度和内径 色谱柱尺寸 颗粒形状--- 球型或不规则型 颗粒形状 粒径--- 平均颗粒直径,通常3-10µm

粒径 表面积--- 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/g表示 表面积 孔径--- 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å 孔径

B. C18色谱柱的性能影响因素 色谱柱的性能影响因素 键合类型--- 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 键合类型 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率---与基体物质相连的键合相的量 碳覆盖率 封端---键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 封端CH3 OH + X Si (CH2)17CH3 CH3monomeric bonding

化 学 性 质

R Si (CH2 )17 CH3 R

OH + OH

CH3polymeric

Obonding

CH3 Si (CH2)17 CH3

X Si (CH2 )17CH3 X

O

Column Selection ChartSuitable for MW >2000 High Resolution High Sensitivity High Efficiency Low Backpressure Stability at pH Extremes High Capacity High Stability Low Mobile Phase Consumption Fast Analysis High Sample Loadability Fast Eqilibration Default Column (Good for most Applications)

Particle Size small (3µm) medium (5µm) large (10µm) Column Length short (30mm) medium (150mm) long (300mm) Column ID narrow (2.1mm) medium (4.6mm) wide (22.5mm) Surface Area low (200m2/g) high (300m2/g) Pore Size small (60Å) medium (100Å) large (300Å) Carbon Load low (3%) medium (10%) high (20%) Bonding Type monomeric polymeric Particle Shape spherical irregular

Method Goals

C. 固定相种类的选择 Step 1 画出所有需要分离的化合物结构，找出结构最相似的一组化合物.HO O HO OH O O OH HO

O

O

Prednisolone

Prednisone

Step 2 Functional Group Polarity ComparisonsPolarity Functional Group Structure Bonding Types Intermolecular Forces Displayed

Low

Methylene Phenyl Halide Ether

R (CH2 )2

σ σ,π σ σ

London London London, Dipole-Dipole London, Dipole-Dipole, H-bonding

RR F, Cl, Br, I

R

OO-

R

Nitro Ester Aldehyde

R

N O

+

σ,π σ,π σ,π σ,π σ,π σ σ,π

London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding

O R O R OR H O

Ketone Amino Hydroxyl High Carboxylic Acid

R R

London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding, London, Dipole-Dipole, H-bonding London, Dipole-Dipole, H-bonding,

R

NH2

R

OH

O R OH

Step3 固定相的作用力类型C18 (ODS)/C8/C4 非极性 色散力作用,疏水性 色散力作用 疏水性 碳链越长,极性越弱 碳链越长 极性越弱 端基封尾的作用比较明显

3 CH

CH O3 CH

3

Si R3 CH 3 CH

OH OH OH OH

O

Si R3 CH 3 CH

+

CH3 Cl Si R3 CH

OH OH

+

OH

3 Cl Si CH 3 CH

3 O Si CH 3 CH 3 CH

R = C8, C18,etc.

O Si R3 CH

(TMS)

O Si R12

Step3 固定相的作用力类型 苯基柱非极性 色散力作用+ 相互作用 色散力作用 π - π 相互作用 杂环化合物和芳香类化合物有独特的选择

性和好的分离效果

H R Si (CH2)3 C R H C C C C

H C H H

Step3 固定相的作用力类型 CN柱 柱中等极性 中等极性 取向力+ 相互作用 作用+疏水作用 取向力 π - π 相互作用 疏水作用

正反相都可以使用 用于反相：对于疏水性强， 上很难洗脱物质， 用于反相：对于疏水性强，在C18,C8上很难洗脱物质，有很好的分离效果 上很难洗脱物质 用于正相：和硅胶柱相比，平衡更容易，硅胶表面活性更一致 用于正相：和硅胶柱相比，平衡更容易，

R Si (CH2)3 C R N

Step3 固定相的作用力类型 NH2柱 柱中强极性 取向力+ 取向力 氢键

正反相都可以使用 用于分离糖类物质

Step3 固定相的作用力类型 Diol-NP柱 柱强极性 取向力+ 取向力 氢键

正相具有优良的选择性,没有过多的保留(亲水性不如硅羟基强) 正相具有优良的选择性,没有过多的保留(亲水性不如硅羟基强) PH(2.0-7.5)

3.2流动相的选择 3.2流动相的选择A. 流动相中的酸(1) Q: 什么时候需要加入酸? A: 分析对象容易发生电离。 (2) Q:加入哪类酸? A:磷酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸和高氯酸。 将酸加入流动相的水相中是对缓冲液的一种简捷且常常是有效的替代方法。 (3) Q:加入酸有何作用? A: 抑制弱酸的电离，以延长保留时间。 分析碱性化合物时，加入酸有竞争硅羟基的作用，可防止拖尾。 (4)Q:这些酸如何选择？ A:离子强度：高氯酸>三氟乙酸>磷酸>甲酸>乙酸 。 离子强度很高的酸，通常会对液质联用产生强烈的抑制，几乎可以让负模式扫描 信号全部被抑制。 高氯酸可作为离子对试剂使用。 三氟乙酸挥发性最强，常用于ELSD检测等情况。17

3.2流动相的选择 3.2流动相的选择B.流动相 流动相PH值与样品保留时间的关系 流动相 值与样品保留时间的关系

3.2流动相的选择 3.2流动相的选择B.流动相PH值与样品保留时间的关系 B.流动相PH值与样品保留时间的关系 流动相PH色谱柱: 色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 µm 流动相: 磷酸: 流动相 44% 25 mM磷酸 56% 甲醇 磷酸 流速: 流速 1.0 mL/min 温度: 温度 25°C ° 检测: 检测 UV 250 nm 0.25 个pH

pH 7.000 1

1

2

4

5 7

3

6

2 1 2

3 Time (min) 4 5

4

5

6

pH 7.250 1

67

3

样品: 样品 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen

2

3 Time (min)

4

5

6

可电离的组份的分离可能会随 变化发生显著变化 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 可电离的组份的分离可能会随 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位 甚至很小的 变化单位. 变化单位

3.2流动相的选择 3.2流动相的选择B.流动相PH值与样品保留时间的关系 B.流动相PH值与样品保留时间的

关系 流动相PH

中性组份

酸性组份

碱性组份

3.2流动相的选择 3.2流动相的选择C. 流动相中的缓冲盐(1) Q: 什么时候需要加入缓冲盐? A:流动相的PH值一般在2.5-7之间，当分析物在反相条件下可离解，或样品的PH 值在2.5-7之外时，就需要缓冲液，在反相条件下可离解的化合物一般有氨基和羧 基，他们的Pka在1-11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团处于一 种形式，离子形式或中性化合物的形式，如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶 液可使其变温和或减小其危害。

(2) Q:选择缓冲盐的几个考虑因素? A:缓冲容量，紫外吸收，溶解性，稳定性，对柱子的作用，对仪器的损害等。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0d3e.html