基因分子生物学复习00

基因分子生物学2010期末复习题总结

一． control of prokaryotic gene expression

Ⅰ名词解释

1. Operon 操纵子，是基因表达调控的基本单位，包含结构基因、操纵基因等一些相邻基因组成的DNA片段，其中操纵基因可被调节蛋白识别并调控，结构基因的表达又受到操纵基因的调控。

2. Inducible operon 可诱导操纵子，当环境出现某一小分子时，与代谢相关的基因表达，即诱导物所诱导的操纵子为可诱导操纵子，如lac操纵子，在诱导物作用下可产生本身代谢所需要的酶。

3. Operator 操纵基因，是操纵子结构基因前的DNA区段，可以结合阻遏物或活化物。常位于基因启动子的后面或与启动子重叠，可控制临近结构基因的表达。

4. Co-repressor辅阻遏物，阻遏蛋白与某一个小分子结合后活性被激活，阻止产生合成这种小分子相关的酶，那么这种小分子称为~~，例如色氨酸。

5. Repressible operon 可阻遏操纵子，共阻遏物所抑制的操纵子为可阻遏操纵子，即共阻遏物的存在可以抑制结构基因所编码酶的表达，如trp操纵子等氨基酸合成相关的操纵子。

6. Attenuator 衰减子， 是E. coli Trp操纵子一段特殊的调控序列。位于上游启动子与第一个结构基因之间，是Trp操纵子含有的一个特殊调节序列，色氨酸操纵子的前导序列有4个关键区，当大肠杆菌细胞中色氨酸水平较高，核糖体迅速的翻译前导序列中的序列1，生成14肽，并在转录序列3之前占据序列2转录产物，以致前导序列转录产物序列3和序列4互补，形成类似终止子的衰减子结构。.

7. Alarmones 信号素，原核生物应急反应中所产生的信号分子，ppGpp or pppGpp(鸟苷4/5磷酸),它们通过与靶蛋白的结合来改变其活性即刻产生调控作用，从而对代谢做出调节。

8. Prophage 原噬菌体，某些温和噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主染色体上，处于整合状态的噬菌体DNA为原噬菌体。它是繁殖和传递噬菌体本身遗传信息的一种重要方式。

9. Riboswitch 核糖开关，是原核生物中一类调节RNA元件，它可以直接感受小分子的代谢来控制转录和翻译，是不依赖调控蛋白的一种调节方式。

10. sRNAs 细菌内小RNA，sRNAs是细菌内长80~100 nt的RNA调控序列。它们一般不由大的RNA前体形成，而是被自身基因所编码产生。大多数的sRNA通过与靶mRNA配对来抑制转录，有些情况也促进转录。

11. Antisense RNAs反义RNA，由+DNA链转录产生。一个RNA可以与某一个基因转录出的mRNA互补，那么这个RNA则称为此mRNA的反义RNA，抑制mRNA的翻译，主要在翻译水平上调节基因表达的一种RNA（少数可调节其转录）。

Ⅱ简答

1. 简述lac operon的调控机制。

Lac操纵子由操纵基因O、结构基因Z、Y、A及调节基因组成。lac操纵子在启动子的-35区缺乏UP元件，为弱启动子。CAP和Repressor分别通过影响RNAP与启动子的结合来对lac基因进行调控。是通过CAP蛋白的正调节和Repressor的负调节这两种调节来实现的

1) 当葡萄糖和乳糖都存在时，由于葡萄糖的存在，细胞中的cAMP 的水平则会降低，而cAMP对CAP的活性是必

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须的，所以此时CAP无活性，不能和CAP site 结合；而由于乳糖的存在，它可以与Repressor结合使其构象改变，从而不能结合在operator上，此时RNAP结合在启动子上，由于lac gene 的启动子是弱启动子，在没有CAP蛋白结合时，RNAP与之的结合比较弱，处于基础水平转录；

2) 当只有葡萄糖存在时，此时CAP 蛋白依然没有活性，不能和CAP site 结合；由于没有乳糖存在，此时阻遏蛋白结合到操纵基因上，启动子和操纵基因有重叠区，Repressor的结合阻止了RNAP与启动子的结合，阻止了转录的发生；

3) 当只有乳糖存在时，cAMP浓度升高，此时CAP与cAMP结合，表现出较高的活性，结合于CAP site；此时乳糖与repressor结合，使其构象改变，不能结合在operator上，RNAP则可与启动子结合；而CAP蛋白具有募集作用，可以帮助RNAP结合到启动子上，从而使得转录水平大大升高；

4) 当两种糖都不存在时，CAP 可以结合到CAP site上；同时repressor也结合到operator上，阻止RNAP 的结合，阻止基因的转录。

2. 如何利用实验证明CAP蛋白的作用机制。

CAP蛋白的作用机制是募集RNAP到启动子上，可以用激活蛋白旁路实验来证明。

1）用蛋白与蛋白的相互作用取代CAP跟RNAP的相互作用：Y蛋白与DNA结合域偶联，X蛋白取代RNAP的α-CTD，只要启动子附近有合适的结合位点，被稀释过的聚合酶就能被拼凑起来的“激活蛋白”激活，结合于启动子起始转录。 2）α-CTD被CAP的DNA结合域取代，在无任何激活蛋白时，只要附近有合适的DNA结合位点，这一修饰过的聚合酶就能有效的起始从lac开始的转录。

3）无任何激活蛋白，但RNAP是高浓度的，基因以激活水平表达。这三个实验说明CAP蛋白只是通过与α-CTD作用，募集RNAP到启动子上起始转录。 3. 为什么常利用lacZ作为reportors？

在乳糖类似物IPTG的诱导下，LacZ编码β-半乳糖苷酶，该酶和底物反应很敏感，可水解二糖的糖苷键使其生成单糖，该反应利用一个生色底物（如X-gal，无色）和?-半乳糖苷酶进行反应，反应后生成蓝色的沉淀，很容易检测。通过测定蓝色产物的产生，不仅可以定性还可以定量测定出?-半乳糖苷酶的活性水平，故常作为报告基因。 LacZ具有操作简单、准确度高、分辨率高、直接反映蛋白表达水平等优点，因此适合做报告基因。 4. Lac repressor如何结合于operators？

Lac阻遏蛋白有DNA结合域，核心域，寡聚化结构域。以四聚体形式与operator结合。

其DNA结合结构域为HTH模体，其中一个α螺旋适合插入DNA的大沟，与其中的特异碱基结合。另一个α螺旋横跨DNA大沟与DNA主链相联系，以保证第一个螺旋出现在正确的位置，同时也增加蛋白质-DNA相互作用的结合能。

C端通过oligomerization（寡聚化）：Monomer—dimer—tetramer，这就形成两个DNA-binding site，可以同时结合两个operator。其中一个必结合一个离启动子最近的一个亲和力最高的operator(O1)，而另一个dimer 结合另一个operator(O2orO3)，之间的DNA 形成loop式结构，从而发挥作用。 5. 举例说明原核activators的主要作用机制。

原核激活蛋白作用的主要机制有二：1）通过募集RNA聚合酶激活转录，如lac操纵子的激活蛋白；2）通过变构作

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用激活RNAP：ⅰ改变RNAP的构象使启动子活化，如glnA启动子的NtrC激活蛋白；ⅱ诱导启动子DNA构象改变，如merT启动子的MerR激活蛋白。

1）CAP:募集作用，与RNAP协同来起始转录；

2）NtrC：与RNAP作用，利用NtrC的ATPase的活性，水解ATP所释放的能量来改变RNAP的构象，使得它从close状态变为open；

3）MerR：改变启动子区的DNA的构象，缩短DNA-35区和-10区之间的距离，并且使DNA发生旋转，从而使-35区和-10区朝同一侧。

6. 举例说明原核repressors的主要作用机制。 原核阻遏蛋白的作用机制有二：

1）抑制RNAP跟启动子的结合，由于阻遏蛋白结合位点与RNAP的结合位点有重叠区，因此RNAP被排斥，如laz操纵子中的Lac阻遏蛋白；

2）阻遏蛋白结合到非启动子位点，与RNAP相互作用，从而抑制转录起始，如E. coli的Gal阻遏蛋白。 8. 简述trp operon的调控机制。

Trp操纵子（typ operon）负责Trp的生物合成，包括启动子，操纵基因及5个结构基因。在第一个结构基因的上游有一段签到序列，其转录产物可以分为4个区域，通过配对调控基因表达。当培养基中有足够的Trp时，这个操纵子自动关闭，缺乏Trp时操纵子被打开，trp基因表达，Trp或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作用。 Trp操纵子的调控机制主要有两种：

1）阻遏作用：trp操纵子转录起始的调控是通过Trp阻遏蛋白实现的。在色氨酸的存在下，它结合到Trp抑制子上，诱导该蛋白构象改变，可结合于操纵基因，抑制结构基因的表达。但该负调控的能力相对较低，此过程中色氨酸为辅阻遏物。

2）衰减作用：trp操纵子转录终止的调控是通过衰减作用实现的。原核生物转录翻译偶联，当转录开始后一段时间，若E. coli中Trp水平较高，核糖体迅速地翻译出前导序列中的序列1，生成14肽，并占据序列2 区域，使前导序列转录产物3和4互补，形成类似终止子的衰减子结构；如果Trp水平较低，核糖体在序列1处翻译出9肽产物，使得序列2和3互补，阻止了衰减子的形成，使转录继续进行。通过Trp的浓度在转录、翻译2个层次调节基因表达。 9. 细菌营养环境极差（如缺乏氨基酸）时如何进行应急反应？

在缺乏氨基酸的环境下，细菌会停止大部分活动，应急反应会使RNA水平降低5~10%，使两种信号素ppGpp及pppGpp聚集，它们通过与靶蛋白的结合来改变其活性。未负载的tRNA与A位点结合，触发应急反应，RelA被活化，合成（p）ppGpp，它们降低了某些基因如rDNA的转录或者是增加另一些基因的转录，部分是因为改变了与RNAP的结合及改变RNAP启动子的特异性。 10. 细菌如何利用Riboswitch调控基因表达？

核糖开关常包含两个结构域：适体结构域(AD)及表达结构域(EPD)。调控机制：核糖开关的适体结构域与小分子结合，传达到表达结构域，进而在转录或翻译水平调控基因的表达。该调控主要通过改变RNA的二级结构来完成的。 概括地说，存在两种机制：核糖开关的作用域由序列1-4四部分组成

1）在SAM存在的状况下，区域1和2配对，区域3和4形成柄环结构，产生了一个发夹终止子，使RNAP在此终

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止转录；如果SAM不存在，则区域2和3配对形成柄环结构，转录得以进行。

2）在SAM存在的前提下，区域3和4形成的柄环结构封闭了核糖体的结合位点RBS而使翻译起始阻止；没有SAM，则区域2和3形成柄环，翻译起始继续进行。在翻译起始阶段，使得RBS序列处于互补区或单链区，来决定核糖体能否结合，从而决定翻译的起始，最终实现对基因表达的调控。 11. 细菌如何调控translation initiation？

简言之，细菌在转录起始主要通过调控蛋白对其调控

1)一种RNA结合蛋白结合到m RNA上的RBS上，通过阻止核糖体小亚基的结合，来抑制了翻译的起始； 2）mRNA分子通过碱基配对自身回折形成二级结构来对翻译起始阶段进行调节

3）通过rRNA的浓度控制是否与r-protein组装成核糖体，进而调控转录。当存在充足的rRNA时，r-protein翻译后与之结合生成核糖体，起始翻译，反之生成的r-protein则与自身mRNA结合，抑制自身翻译。 12. 简述细菌sRNAs的结构特征、产生机制及功能。

特点：其sRNA比真核生物的小分子RNA大很多，为80~110 nt；

产生机制：由基因直接编码形成其最终产物，而不是由大分子RNA的前体加工而成； 功能：大多数sRNA与靶mRNA互补使其降解，抑制翻译，也有促进翻译的报道。 1）sRNA可与和RBS互补的序列配对，释放RBS，进而激活翻译； 2）sRNA也可以与RBS序列互补配对，抑制核糖体的结合，抑制翻译。 13. 简述λ repressor & Cro protein的作用（action）。

λrepressor：维持溶源性途径。PRM作为CI的启动子，可以结合RNAP，最终编码λrepressor。λrepressor二聚化后与OR1结合，该结合通过协同作用又促进了与OR2的结合，由于OR2与 PR和PRM有overlap，使得λrepressor的结合阻碍了RNAP与PR的结合，阻碍了立即早期基因的转录，而对其本身的PRM来说则可以募集RNAP，促进RNAP与PRM结合，使其进一步表达λrepressor，形成一个正调控反馈，维持溶源状态；

Cro protein：维持溶菌性途径。 Cro 与OR3的亲和力最高，Cro形成二聚体后，首先与OR3结合，而OR3与PRM有overlap，这样就阻碍了RNAP与PRM的结合，限制了CI的λrepressor表达，从而无法抑制RNAP与PR的结合，使得Cro蛋白表达，维持溶菌状态

14. 简述λ噬菌体Establishment of lysogeny的过程。

CI有两个启动子，PRE和PRM。在感染早期，由于PRE太弱，首先需要cⅡ表达CⅡ蛋白，CⅡ蛋白作为激活剂，结合在相当于PRE的-35区的cII结合位点上，这样帮助募集PRE的RNAP，从而激活CI的表达，生成λrepressor；之后λrepressor结合到OR上，募集PRM的RNAP，来维持溶源状态

当建立了溶源性时，cⅠ基因从PRE开始转录，当这一状态得以维持时，cⅠ基因从PRM开始转录，产生λrepressor，结合在OR1和OR2上，激活了维持模式的表达(PRM)并且关闭了建立模式的表达(PRE)。宿主菌的生长情况关系到FtSH水解酶的活性，而CⅡ蛋白是FtSH水解酶的底物。若生长良好，FtSH水解酶有活性，可以裂解CⅡ蛋白, Cro蛋白保留，进入溶菌途径。反之选择溶源途径。 15. 简述N蛋白和Q蛋白的抗终止机制。 N蛋白调控早期的基因表达，作用于3个终止子，它阻止在λ早期操纵子的终止，其作用的位点为nut。RNAP一通

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过nut位点，N蛋白即结合到RNA上，并通过RNA装载到RNAP上。在这种状态下，RNAP可以抵抗N和cro以外的终止子。N结合在RNA上的BoxB上，作用于立即早期基因的终止子tR结构上，形成抗终止复合物，使得转录得以继续进行，是进入延迟早期基因所必须的；

Q蛋白识别于晚期启动子PR’-10和-35区之间的DNA序列QBE。无Q时，RNAP结合并起始转录，但在进行仅16或17 nt后暂停，然后终止于下游约200 bp的终止子tR’；如果Q存在，RNAP一离开启动子，Q就结合QBE，并移动到在附近停留的RNAP，RNAP装载了Q蛋白就能通过tR’。 是晚期基因完成转录所必须的。

二．Gene regulation in eukaryotes

复习题（一） Ⅰ名词解释

1. Chromosome 染色体，基因组的一个相对独立的单位，是遗传物质基因的载体。每个染色质都是有一个双螺旋DNA 和其质量相当的蛋白质组成；仅在细胞有丝分裂期是可见其形态。

2. Chromatin 染色质 由DNA和蛋白质组成，存在于真核生物细胞核内，处于分裂间期的一种DNA的存在形式。 3. Two-hybrid assay 双杂交法，用来判断蛋白是否相互作用的方法，编码蛋白A的基因与编码Gal4 DNA结合结构域的片段融合，编码蛋白B的基因与编码活化结构域的片段融合，当两种融合蛋白在细胞中同时表达，且AB蛋白之间产生相互作用，则会产生一个完整的激活蛋白，使报告基因表达,即可检测是AB蛋白间是否有相互作用。 4. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) 染色质免疫沉淀，用来判断给定蛋白与细胞内基因组DNA的结合部位。其主要步骤为：

1) 蛋白质A与特定的DNA 序列相结合，用甲醛固定，使这种结合状态稳定； 2) 细胞裂解，超声破碎DNA至其片段在200-300bp间；

3) 加入A蛋白的抗体a,利用沉淀技术将抗体a-蛋白质A-DNA复合物分离出来

4) 利用解交联技术使得DNA与蛋白质A、抗体a分离，即得到与蛋白质A特异性结合的DNA； 5) 利用PCR技术扩增出特异片段就可确定结合的位点。

5. Bromodomain 布罗莫结构域，实际上是真核生物中的一种蛋白模体，发现于果蝇brm基因的表达产物而命名，它存在于参与染色质活化或促进有丝分裂信号作用等核蛋白中，含有61~63（或~110）个保守氨基酸，识别并结合乙酰化的Lys，介导蛋白质间的相互作用，并募集重要的功能复合物。

6. Chromodomain 克罗莫结构域，即染色质结构修饰结构域，是一种真核生物的蛋白模体，高度保守，含30~50个氨基酸，结合甲基化的Lys残基，存在于动、植物细胞核内参与调节染色质结构的若干蛋白质中。

7. Insulators 绝缘子，通常位于增强子同启动子之间，其本身对基因的表达没直接效应，与绝缘子结合的蛋白质既不抑制启动子的活性，也不抑制激活蛋白的活性，它们只是阻碍两者之间的联系，其作用是避免远距离作用的非特异性，使增强子只能对特异的启动子发挥作用，还可以阻断影响基因表达的染色质修饰复合物的扩散，无需结合阻遏蛋白即可关闭某些基因的表达。其作用具有方向性。

8. Locus control region 基因座控制区，有许多增强子或绝缘子元件组成，它可以控制个体基因的有序表达，但机制未知。可能通过募集染色质重塑复合物或者使通过募集转录机器来行使其功能。 9. Gene cluster 基因簇，一组紧密连锁的且功能上密切相关的结构基因。

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10. Hypersensitive sites 高敏位点，染色质中比较短的区域，由于对DNaseI和其他核酸酶极其敏感而被发现，包括除核小体外的区域，这些区域都是转录的活性区域。

11. Housekeeping genes 管家基因，对于细胞生存必不可少的组成性表达基因，市在所有细胞都表达的基因，它们为所有类型的细胞提供基本的功能需求。

12. Combinational control 组合调控，多个激活蛋白的协同作用或激活蛋白跟抑制子的相互作用对转录的调控为组合调控，不同的组合保证各类细胞表达不同的基因。

13. Coactivator 辅激活蛋白，通常指任何辅助性激活蛋白质，它们不是转录机器的一部分，本身也不是DNA结合的调节蛋白，但是却参与基因的转录调节，此概念也指其它对核小体具有修饰功能的复合物，可能是组蛋白甲基化酶或者其它的核小体修饰复合物。在辅激活蛋白的作用下，可以促进转录。

14. Corepressor辅阻遏蛋白，通常指任何辅助性阻遏蛋白质，它们不是转录机器的一部分，本身也不是DNA结合的调节蛋白，但是却参与基因的转录调节，此概念也指其它对核小体具有修饰功能的复合物，可能是组蛋白甲基化酶或者其它的核小体修饰复合物。在辅阻遏蛋白的作用下，可以抑制转录。

Ⅱ简答

1．真核与原核的activator的募集作用有何区别？

原核激活蛋白结合到DNA上且与RNAP相互作用，直接将RNAP募集到基因上。真核生物的激活蛋白也以这种方式作用，但是募集是间接的。真核生物的激活蛋白通过染色体重塑复合物、乙酰转移酶、中介体复合物的介导来募集RNAP.

在真核中1）激活蛋白募集转录机器某些组分，这些组分再募集RNAP；

2）激活蛋白能募集核小体修饰成分来间接募集RNAP，即改变染色质的结构，使转录区活化，帮助RNAP

结合：A:募集依赖ATP的染色体重塑复合物；B：不依赖ATP的一些酶，如HAT

3）激活蛋白可以募集转录所需的某些蛋白因子，如通用转录因子等。

2. DNA binding motif的recognition strategy是如何进化的？举例说明。 DNA结合结构域在进化上有两个分支:

(1) 以α螺旋的形式嵌入到DNA大沟中，如原核生物中的HTH，以及真核生物中较常见的四类DNA结合结构域：锌指结构，亮氨酸拉链，HLH(螺旋-环-螺旋)，同源异型域；

(2)大量的调节蛋白在进化上有另外一个完全不同的识别策略，即利用双链的?-sheet与DNA结合，以一对反平行折叠插入到DNA中，例如细菌Met受体，当SAM大量存在时，SAM与Met受体结合，使得Met受体以?-sheet的形式与DNA紧密结合，从而使得编码合成Met的酶类的基因关闭，从而抑制了Met的合成；

另外，少数的DNA结合蛋白利用突出的loop与DNA结合，如p53 3. 简述activators如何指导Local alterations in chromatin（染色体改变）。

两种模型：1）激活蛋白结合到其相应的结合位点，募集组蛋白乙酰转移酶（HAT），该酶在His末端添加乙酰基团使组蛋白乙酰化，使核小体由紧凑的结构变得松弛，Promoter得以暴露，可与转录机器相互识别；2）激活蛋白结合到其相应的结合位点募集染色质重塑复合物，依赖ATP水解释放能量，改变启动子附近的核小体结构，使其变得可接近并且能同转录机器结合。

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4. Chromatin remodeling complexes改变nucleosome organization的主要方式有哪些？

方式有三：1）核小体滑动，使DNA序列位置改变，暴露结合位点；2）核小体间隔发生调整，使其间隔变得均匀，从而使原来不暴露的序列得以暴露；3）核小体的某段组蛋白被取代，DNA双链裸露，使结合位点得以暴露。 5. 简述Histone modifying enzymes的主要作用方式及其效应。

对组蛋白修饰的酶主要包括组蛋白乙酰化酶，组蛋白去乙酰化酶，组蛋白甲基化酶，DNA甲基酶等。他们主要是对核小体N端尾巴的修饰，方式有：1）组蛋白乙酰化（活化）去乙酰化（失活）；2）组蛋白甲基化（失活）去甲基化（活化）一般发生在lys上；3）DNA甲基化、去甲基化的修饰。这些修饰，提供了新的蛋白质结合位点。 6. 在真核基因转录前如何改变（活化）染色质结构？

简言之，染色质重塑蛋白及组蛋白修饰复合体的协同作用使染色质活化。TopoII切割dsDNA的两条链， PARP-1修饰DNA，去除H1代之以HGMB，利于转录进行。

基因活化蛋白与染色质（30 nm纤维）结合→募集组蛋白修饰酶（如HAT）→10 nm的染色质纤维→募集核小体重塑复合物，染色质结构进一步松散→核小体滑动，染色质活化→募集其它活化蛋白→起始转录 7. 何谓真核activators的“synergy”（协同、增效作用）

简单的说，就是多种激活蛋白通过共同作用，协同地使基因打开，增效作用对激活蛋白引发的信号整合是至关重要的。在该过程中，每个激活蛋白可以募集转录机器中一种或几种成分，帮助他们结合到各自的特异位点，通过激活蛋白的增效作用对信号整合十分重要。其协同结合体现在三个方面：1）两者直接相互作用；2）两者与第三者作用；3）间接作用，A的结合可以帮助B结合。 8. 何谓“enhanceosome”？举例说明。

激活蛋白以协同作用的方式结合在增强子上形成的结构被称为增强体。如人类β干扰素增强体。在人类β干扰素基因启动子上游约1kb处有一个增强子，3个激活蛋白将协同的一个个与其增强子结合，这些调节蛋白结合在增强子上形成的结构被称作增强体。若无activator结合的话，DNA处于一定的弯曲状态，一旦结合，DNA将被拉直，染色体的构象发生变化，当3个激活蛋白都结合后，β干扰素才能表达。

现在发现有3种activators可以结合该基因片段：结构蛋白HMGA1结合DNA 后，使其构象发生改变，由弯曲状态变成直线型，之后三种activators NFk-B、IRF、Jun-ATF二聚体便可以结合到其相应的结合位点，即形成增强体，来发挥作用。

9. 简述真核与原核Repressors作用方式的主要区别。

原核中，阻遏蛋白主要的作用方式：1）与启动子的重合位点结合；2）结合在启动子附近，阻止RNAP进入，抑制转录起始；3）干扰激活蛋白的功能。

真核中，阻遏蛋白的作用方式与没有原核中的第一种调控方式，但它有另外的作用方式：最普遍的方式是阻遏蛋白募集核小体修饰复合物，从而使染色质变得更紧凑或是去除能够被转录机器所识别的基因。如组蛋白去乙酰化酶通过移去组蛋白尾巴上的乙酰基团，抑制转录；其他酶增加组蛋白尾巴上的甲基基团，抑制转录，达到基因沉默的效果。通过3种方式进行：1）阻遏蛋白结合位点与激活蛋白结合位点有重叠，阻遏蛋白通过与其特异位点的结合，阻止激活蛋白的结合；2）阻遏蛋白与其结合位点结合之后，抑制与激活蛋白位点结合的激活蛋白发挥转录激活作用；3）阻遏蛋白与中介体复合物结合，直接发挥阻遏作用；4）通过募集组蛋白去乙酰酶发挥基因沉默效应。

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10. 举例说明调控真核与原核transcription regulators活性方式的主要区别。

原核的调控主要发生在转录调控因子与DNA结合的水平上，如乳糖抑制子在缺乏乳糖时才跟DNA结合。 真核的调控有两种方式：1）活性区的暴露：通过与DNA结合的激活蛋白构象的改变或者释放隐蔽蛋白，使先前被掩蔽的活化区暴露出来。如酵母Gal4的调控，无半乳糖时，它被Gal80的蛋白所隐蔽，半乳糖的结合促使Gal80去除，此时Gal4才能被活化；2）运输转录因子出入细胞核来对转录发挥作用：这些调节因子通过与抑制性蛋白相互作用，或者与细胞膜相互作用，将转录因子锚定在细胞质中，使之无法进核发挥作用；或者以某种构象存在，调控因子被限制在细胞质内，如果蝇胚胎背轴的形成，Cactus是抑制蛋白，在细胞质中与调控因子Dorsal结合，对于特定信号应答，Cactus磷酸化后被降解，Dorsal得以入核行使功能。

11. 简述control of cell cycle的three checkpoints。

细胞周期调控的三个关卡：1）起始关卡位于G1末期，这是一个限制点，正要进入DNA复制的S期；2）G2/M，在该期要检测DNA是否完全复制，环境是否合适；3）中期向后期的过渡关卡，此点检测是否所有染色体已跟纺锤体连接。

二．Gene regulation in eukaryotes

复习题（二） Ⅰ名词解释

1. Pc (or Pc-G) protein Polycomb (Group)蛋白，是最早发现于果蝇中的一个蛋白家族，是一种蛋白质复合物，在基因组中有15个基因座，其主要功能是维持阻遏状态，它本身不与DNA直接结合，可被阻遏蛋白募集与染色体。具有克罗莫结构域，可与甲基化的蛋白结合，通过与PRC1、PRC2的作用，使大范围的基因沉默。

2. Imprinting 基因印记，来自父母双方的同源染色体或等位基因存在着功能上的差异。由不同性别的亲体传给子代的同一染色体或基因，表现出功能上的差异，引起不同的表型。一般发生在哺乳动物的配子形成期，并且是可以逆转的。其本质是DNA 甲基化，是一种DNA序列不改变的表观修饰。印记持续在个体的一生中，在下一代配子形成时旧的印记可以消除，并发生新的印记。

3. CpG islands (CG islands) CpG岛，是哺乳动物基因组中聚集的、长度为1~2 kb富含非甲基化的CG二核苷酸DNA序列，一半位于组织特异性的启动子区和一半位于管家基因的启动子区，以保证这些基因的持续性表达。 4. Epigenetic regulation 表观遗传调控，是一种不改变DNA序列结构，通过DNA甲基化、组蛋白修饰、小分子RNA介导等作用来实现染色质水平上的结构调整，从而改变基因表达，改变生物表型的真核生物特有的调控机制。 5. Alternative splicing 选择性剪接，指对同一pre-mRNA以多种不同的方式进行剪接，使由一条pre-mRNA在选择性剪接的作用下可生成多条成熟的mRNA，这些mRNA又产生多种不同的蛋白质。某些基因的选择性剪接具有组织特异性或受发育调节。

6. trans-splicing 反式剪接，存在于低等生物中，指两条不同的mRNA的外显子连接到一起。与正常的剪接方式相比，反式剪接的两段外显子来自不同的mRNA，但可能是来自同一基因。

7. editing RNA编辑，是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程。基因转录产生的primary RNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置换，导致RNA中的编码信息发生改变，常见的有加入多个U，C脱氨基成U，A变成I等，使翻译生成的蛋白质的mRNA模板中的信息与基因序列中的编码信息不一致，这种现象称为RNA编辑。

8. guide RNA 引导RNA，长度大约是60～80个核苷酸,是由单独的基因转录的,具有3’寡聚U的尾巴、编辑区和锚

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定区。锚定区同被编辑的mRNA序列互补，将gRNA定位于特定位置。在编辑时,内切酶对未与gRNA配对的mRNA上的序列进行切割，产生缺口，以碱基配对原则加入相应的核苷酸，通过连接酶作用产生编辑好mRNA。gRNA3’端的poly-U尾可作为被添加的U的供体。

9. P bodies Processing bodies 加工体，P小体是细胞质中不连续的区域，富含大量核酸酶，存在很多参与转录后调控的细胞因子。主要作用是储存和降解mRNA，如siRNA、miRNA引起RNA降解时，先将RNA定位于P小体中，再降解。不过也有P小体保护mRNA的报道（蠕虫卵细胞）。

10. LincRNAs Large Intervening Noncoding RNAs 大的可插入非编码RNA，是真核生物中一类进化保守的非编码RNA，其长度从几千到上万nt，它可能起到结合并引导阻遏蛋白与启动子结合，从而使基因沉默。

Ⅱ简答

1. 简述Budding yeast（芽殖酵母）的端粒区heterochromatin（异染色质）发生silencing的过程。

简言之，芽殖酵母端粒异染色质发生沉默通过对组蛋白的乙酰化和甲基化完成的。首先，Rap1蛋白可识别端粒异染色质区的重复序列，并与端粒DNA发生结合。之后募集Sir复合体至端粒。Sir复合体中的Sir2是组蛋白去乙酰化酶，使组蛋白去乙酰化，去乙酰化的尾部与Sir3跟Sir4结合，然后募集更多的Sir复合体，从而允许Sir2作用于更远的核小体，循环往复，发挥扩展作用，使周围的核小体去乙酰化，端粒的异染色质得以沉默。扩展作用挂在特定的位点停止，不延伸到常染色质区。主要是利用甲基化酶使组蛋白H3和H4中的Lys残基甲基化，从而阻止Sir2的去乙酰化作用。

2. Is there a histone code（组蛋白密码）?

过去认为，组蛋白的修饰在某种程度上决定基因是否有活性。如H3K9（组蛋白H3上第9位的Lys）的不同修饰决定着基因的开启或关闭。1）甲基化修饰使基因关闭形成异染色质；2）乙酰化修饰使基因开放，具有转录活性；3）无修饰，基因沉默。但是近几年发现许多个例，不同组蛋白位点间的修饰可相互影响。如当H3K9甲基化后，与HP1结合科抑制转录，但当H3S10磷酸化后，H3K9无法与HP1结合，基因仍处于活性状态。

目前对于组蛋白密码有很多争议，认为组蛋白的修饰可能只是基因开启或关闭的一个结果。 3. 在哺乳动物基因组中，如何实现stable gene repression或gene firmly shut off？

组蛋白的修饰和DNA甲基化对于维持基因抑制的稳定性十分重要，且认为DNA的甲基化发挥着更重要的作用。真核生物基因组中大部分序列不编码蛋白质，其中多为转座子的遗留产物，发现这些遗留产物多被甲基化，使之沉默。DNA甲基化发生在CG中的C上，催化甲基化的酶有从头甲基化酶和维持甲基化酶。从头甲基化酶可在胚胎阶段是DNA甲基化，维持甲基化酶可在DNA复制过程中使新合成的链甲基化，与旧链相同。

当某基因不被表达时，DNA甲基化酶将甲基化启动子序列、基因本身、上游activator结合位点序列中的C，从而破坏转录机器，activator与位点的结合，此甲基化序列还可被DNA结合蛋白识别，DNA结合蛋白可募集组蛋白去乙酰化酶和组蛋白甲基化酶，从而改变核小体的构象，使基因表达完全关闭，即DNA甲基化和组蛋白修饰相结合，使基因稳定的关闭。

4. 何谓imprinting？imprinting是如何发生的？

基因印记，在二倍体细胞中，来自父母双方的同源染色体或等位基因存在着功能上的差异。由不同性别的亲体传给子代的同一染色体或基因，一个等位基因表达而另一个不表达，表现出功能上的差异，引起不同的表

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型。一般发生在哺乳动物的配子形成期，并且是可以逆转的。其本质是DNA 甲基化，是一种DNA序列不改变的表观修饰。印记持续在个体的一生中，在下一代配子形成时，旧的印记可以消除，并发生新的印记。

这种基因印记可以遗传，是一种性别特异性的遗传方式，属于表观遗传。遗传印记在哺乳动物体细胞中是预先设定的，但在配子形成时可以被改写。在产生配子的时候，雌性动物卵细胞中的等位基因的甲基化状态和其体细胞中的母源等位基因的甲基化状态相同；而雄性动物产生的精子中等位基因的甲基化状态和其体细胞中父源等位基因的甲基化状态相同。

5. 为什么identical Twins（同卵双胞胎）可能一个健康，另一个患遗传性疾病？举例说明。

同卵双胞胎具有相同的基因序列，但在许多实例中，双胞胎中的一个患有遗传疾病，但另一个没有。环境因素可能有一定作用，但是很多科学家认为可能是表观上的，在染色体，但非DNA上的转变导致了这种现象。比如，Beckwiht-Wiedemann综合征，发现患病的一方11号染色体关键部位印记丢失，而健康的一方却具有这一印记。基因印记在血多方面都有所表现，但其机理仍不清楚，可以肯定的是，DNA 甲基化发挥着重要作用。 6. CpG islands在进化过程中是如何产生的？

CpG岛，是哺乳动物基因组中聚集的、长度为1~2 kb富含非甲基化的CG二核苷酸DNA序列，一半位于组织特异性的启动子区和一半位于管家基因的启动子区，以保证这些基因的持续性表达。

在古老的脊椎动物基因组中CG二核苷酸序列排列均匀散布于基因组中，其中大量C甲基化，不重要的位点mC脱氨基后形成T，但重要位点C甲基化是致命的，在漫长的进化过程中，甲基化的C逐渐被T淘汰，而保留下来的CG二核苷酸序列中的C因处于重要的基因调控区而不能被甲基化，从而保留，形成CpG岛。 7. Eukaryotic gene expression可能有哪些阶段（steps）受到调控？为什么说这些阶段之间相耦联？

有六个阶段：1）转录调控；2）RNA加工调控；3）RNA的转运和定位调控；4）翻译调控；5）mRNA的降解调控；6）蛋白质活性的调控

对于mRNA来说，其不同阶段的加工在不同水平上相互联系，转录、RNA加工及mRNA的运输等过程是相耦联的；同时，许多mRNA的加工因子是共转录的，转录的完成需要不同的成分，跟mRNA加工的不同阶段相耦联。比如，mRNA的转录和剪接加工是同时进行的，转录开始后不久就会发生5‘加帽，并且募集pre-mRNA加工所需要的酶和相关剪接因子；另外，细胞核向细胞质输送过程就控制着输送因子、染色质重塑因子、剪接因子、外切酶体等等调节因子的运输，从而控制了mRNA的加工、定位、降解等过程，进而影响了基因的表达。所以真核基因表达调控的各个阶段就是相互影响和相互作用的。

8. 组织（细胞）特异的Alternative splicing是如何发生的？

1）pre-mRNA上存在剪接位点和阻遏蛋白结合位点，且相互靠近，当细胞中表达阻遏蛋白时，可结合到repressor site上，限制剪接体与其相应的位点结合，从而保护该位点不受剪接；反之，当细胞中不表达阻遏蛋白时，则剪接体与其相应的位点结合，实现剪接

2）存在剪接增强子（ESE外显子剪接增强子/ISE内含子剪接增强子）：当细胞中存在activator时，与增强子结合，可将剪接体募集到剪接位点，发生剪接；反之，不发生剪接

首先，选择性剪接存在多种形式：剪接位点可处于外显子、也可在内含子； 其次，选择性剪接是受到调控的。

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9. 人类蛋白质编码基因数和细胞内蛋白质种类数是否大致相当？为什么？

并不相当，原因有许多：1）RNA剪接的存在。RNA剪接包括选择性剪接、反式剪接、自我剪接等，每种剪接方式都会使同一RNA产生多种不同的剪接产物，进而产生不同的蛋白质；2）RNA编辑则导致了遗传信息在RNA水平上发生改变；3）RNA不同断裂位点、加尾、加帽位点的选择也会产生不同的RNA产物；4）进化过程中，由RNA剪接造成的外显子重排，则造成了蛋白的多样性。

10. 真核蛋白质分子如何跨膜转运（注：此题本意想问mRNA的跨膜转运）？

转运通过核膜上的核孔复合体（NPC）来完成，这是一个主动运输的过程，需要GTP水解提供能量，该反应由Ran催化完成。被转运的分子携带了细胞核定位信号，转运受体识别这些信号后指导其通过核孔离开细胞核。一旦进入细胞质，蛋白质组分便解离下来，载体被识别后运回细胞核；然后再与其它分子结合，重复下一次运输。

输出核：细胞核内Ran与GTP结合形成Ran-GTP，而Rna-GTP与核转运受体结合，并与带有核定位信号的被转运蛋白结合，通过核孔进入到细胞质中，GTP水解释放cargo，转运受体输回细胞核；

输入核：在细胞质中核转运受体与被带有核定位信号的转运蛋白结合，通过核孔进入细胞核，在核内Ran与GTP结合形成Ran-GTP，而Ran-GTP与核转运受体结合释放被转运蛋白，Ran-GTP与核转运受体通过核孔进入到细胞质中，GTP水解释放转运受体输回细胞核。

11. 真核mRNA分子在细胞质中localization的方式有哪些？ 真核mRNA在细胞质中的定位有三种方式：

1）通过细胞骨架的纤维蛋白，利用ATP水解释放的能量，使得mRNA直接转运到细胞质的相应位置； 2）mRNA随机扩散，可与膜上的锚定蛋白结合

3）细胞质中的mRNA只有与锚定蛋白结合才可实现正确定位，而非结合的蛋白则被降解 12. 为什么说editing的发现是对中心法则的补充？如何评价editing在进化中的地位？

所谓的RNA编辑，是在RNA水平上改变遗传信息的加工过程，导致成熟的RNA编码的序列跟它的转录模板DNA序列不再匹配，即DNA遗传信息不再真实地反应在RNA序列中。因此，它是对中心法则的补充。

RNA编辑可能发生在细胞进化早期阶段的RNA合成过程的“分子化石”，即生命早期RNA复制中的一种误差校正机制残留的痕迹。在生命起源过程中可能出现的RNA世界，由于RNA复制误差较大，可能需要RNA编辑作为一种校正机制，以维持遗传信息的忠实性。

13. Translational control of eukaryotic gene expression主要有哪些方式？举例说明。 方式有四：

1）翻译抑制蛋白跟调控序列结合，阻止核糖体的结合起始密码子AUG，抑制翻译起始；

2）通过核糖开关来调控：SAM与其核糖开关结合，使核糖开关结构改变，封闭了AUG，翻译无法起始，SAM去除使AUG暴露，翻译起始；

3）mRNA自身形成二级结构，封闭了起始位点，当温度升高，破坏了RNA的发夹二级结构使AUG暴露，翻译进行；4）反义RNA可通过是否与AUG结合来调控翻译； 5）polyA的长度的调节； 6）mRNA的降解

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以细胞内Fe水平的调控为例

1）当细胞内Fe水平很低时，阻遏蛋白结合到编码铁蛋白的mRNA的5'-UTR，形成特征性二级结构，阻止核糖体的结合，从而抑制铁蛋白的合成；当细胞内Fe水平很高时，Fe与阻遏蛋白结合，使之构象改变离开mRNA的5'-UTR,从而核糖体可以结合，起始翻译。

2）当细胞内Fe水平很低时，阻遏蛋白通过结合到编码运铁蛋白受体的mRNA的3'-UTR上，形成特征性二级结构，保证了mRNA的稳定性，使得运铁蛋白受体稳定合成。当细胞内Fe水平很高时，Fe与阻遏蛋白结合，改变其构象，使其从mRNA上脱离，暴露了mRNA上的内切酶位点，使mRNA被降解，从而限制了运铁蛋白受体的合成。 14. Eukaryotic mRNA decay主要有哪些方式？

主要有两种：首先，poly-A逐渐缩短，当polyA短于30个时不稳定，然后：1）5’脱帽，从5’→3’快速降解；2）不脱帽，迅速从3’→5’降解。

15. 拟南芥细胞中的RNAP IV和RNAP V的主要功能是什么？ 催化siRNA的形成，并和异染色质的形成密不可分

RNAP IV：1)可以直接利用甲基化的DNA做模板来进行转录；2)可以利用单链RNA做模板来产生双链RNA，然后经过切割加工产生siRNA；3)与DNA、染色质的表观遗传修饰相关 RNAP V：介导异染色质的形成

16. 以“美臀羊”表型的基因表达调控模式为例，解释“中心法则已经过时”的原因。

中心法则过于简单：DNA转录RNA，RNA翻译蛋白，蛋白完成几乎所有的工作。中心法则给人以错误的暗示，往往把表达蛋白的DNA才叫做基因，然而实际上，编码蛋白的DNA只占人类基因组的2%，越来越多的调控RNA被发现，而它们本身并不翻译蛋白。同时，DNA，RNA及表观遗传的标记形成链锁，并且存在自我调控的系统，显然需要新的理论来取代中心法则。

拿美臀羊来说，即便美臀羊（雌）含有美臀基因c?遗传给子代，子代表型依然正常，并且携带双突变等位基因c?的绵羊表型正常。显然，这用中心法则很难解释。

研究发现，绵羊18号染色体靠近端粒区的高度保守结构域DIK1-GtI2印记结构域内，出现了A→G突变，这是野生绵羊跟美臀羊的唯一区别。该区域存在很多编码基因及非编码基因，在正常状态下，DIK1-GtI2印记结构域父源（表达蛋白Dlk1）跟母源基因（表达Gtl2、Meg8 小分子RNA）的甲基化区域不同，二者受印记调控元件IG-DMR的调控。A→G突变后，父源基因CPat表达Dlk1蛋白的量增多，肌肉纤维比例增大，脂肪减少，母源基因CMat表达的Gtl2、Meg8等调控RNA的量增多。对于纯合子CPat/CMat，由于高表达的Gtl2、Meg8抑制Dlk1，故表型正常；对于杂合子CPat/-，由于缺乏Gtl2、Meg8的抑制，故Dlk1高表达，表现为美臀；对于杂合子CMat/-，由于Dlk1不会高表达，表现为正常。

三．Chromosomes, Chromatin & Nucleosomes

Ⅰ名词解释

1. Centromere 着丝粒，位于异染色质区，是染色体上一个高度压缩的结构区域。是真核生物细胞在进行有丝分裂和减数分裂时，染色体分离的一种“装置”，具有连接纺锤丝的作用位点。

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2. Telomere 端粒，存在于线性染色体末端的一个特殊结构（DNA重复序列），它可以抵抗染色体重组和DNA降解，还可以作为染色体末端复制的特殊起点，保证染色体末端的完整性。

3. Chromatin 染色质，间期细胞核内能被碱性染料染色的物质，是遗传物质存在形式，为DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成的复合物。染色质有常染色质和异染色质两种状态。

4. Chromosome scaffold 染色体支架，处理处于分裂中期的细胞，去除组蛋白得到的蛋白质复合物即为染色体支架，形状类似于分裂中期的姐妹染色单体，由TopoII和SMC蛋白组成，是30nm纤维形成染色体所必须的结构蛋白。 5. Nuclear matrix 核基质，利用去污剂、DNase、RNase和高浓度盐处理分裂间期细胞核，核膜内将出现的散布的网络纤维状结构。主要包括一些纤维蛋白、大的RNA分子以及一些DNA复制和转录所需要的酶类。

6. Cohesion 黏结蛋白，由两分子SMC和另一非SMC蛋白组成,形成环状结构。作用是将两条姐妹染色单体连接在一起，维持染色单体在分离之前相互连接的状态。

7. Condensing 凝聚，在一轮细胞分裂中，染色体的结构发生多次变化。当细胞的染色体分离时，染色体处于最压缩的状态。形成这种压缩状态的过程称为染色体凝聚。凝聚状态下，染色体间完全独立，大大方便了分离过程的进行。 Condensins：凝聚蛋白，由SMC蛋白组成，形成环状结构，作用是将一条染色体的不同区域连接起来，保证单一染色体有效的压缩，维持其凝聚状态。

8. Pseudogene 假基因，基因组中功能基因的有缺陷拷贝，其中缺陷包括无义突变、移码突变、控制区突变等。即与有功能的基因在核苷酸顺序的组成上非常相似，却不具有正常功能的基因，无法编码由功能的蛋白质产物。 9. Packaging Ratio 包装比，基因组DNA分子的全长与包装它的外壳的直径之比，反映DNA分子的凝聚状态，可以保护DNA免受降解，有利于精确地将它分配到子代，使基因表达，调控构成组构。

10. Nucleosome 核小体，是染色质的基本组成单位，包装紧密，由DNA和组蛋白组成。147bp的核心DNA绕核心组蛋白8聚体[H3

×2+H4×2+(H2A+H2B)×2]

1.75圈，再由连接DNA与H1将各个组蛋白核心连接，构成完整的核小体。

11. Histone fold 组蛋白折叠，指核心组蛋白中的保守区域，由3个α螺旋组成，被2个不规则的环隔开，组蛋白折叠调节特异配对的组蛋白异源二聚体的形成，来实现核小体的组装。

12. The lampbrush chromosome 灯刷染色体，一般染色体压缩紧密，高度致密，而两栖动物卵母细胞在减数分裂期形成含有4个染色单体的高度伸展的染色体中间紧密，两端松散，呈灯刷状，称为灯刷染色体。灯刷染色体两侧的松散区具有转录活性。可以合成大量的RNA，为卵母细胞将来的发育做准备。

13. Polytene chromosomes 多线染色体，指双翅目蝇类幼虫某些组织中存在的光镜下可见的巨大染色体，由于细胞多次复制但不分裂，以伸展状态聚集于细胞内而形成的长度长、直径宽的染色体。可利用其特性通过原位杂交来实现基因定位等。

14. Puff 膨突，又称巴氏环，是多线染色体某一区域中的DNA形成环形结构，类似突出状，不再保持原来的压缩状态，可发生基因的活性转录，与多线染色体上某一区带的RNA合成相关。

15. Nucleosome Positioning 核小体定位，由于默写协助蛋白的作用，使得核小体倾向于在某些特定的位置进行组装。这种组装使得定位区附近的DNA位于linker区，处于暴露状态，可与某些活性蛋白结合，进行活性转录。这种现象称为~。通过两种模式：1）通过DNA结合蛋白的协助来实现核小体的形成；2）通过两种蛋白质的结合使得其距离<150bp,无法形成核小体，使DNA暴露。

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Ⅱ简答

1. 生物体复杂程度与基因组基因密度有什么关系？并解释这种关系产生的原因。

生物体的复杂程度与基因密度之间存在大致负相关的关系：生物体复杂程度越低，其基因密度越高。随着生物体复杂程度的增加，其基因大小及基因非编码序列也会增加。

一是复杂生物基因长度的增加导致密度降低。首先，当生物体的复杂性增加时，负责指导和调控转录的DNA区段――调控序列的长度显著增长；其次，在真核生物中编码蛋白质的基因通常是不连续的，内含子的增加极大的增加了编码一个基因所需的DNA长度。

二是在复杂生物中基因间隔区序列数目的大量增加导致了基因密度的降低。基因间隔区是基因组上与蛋白质和结构RNA的表达无关的那部分DNA。大量进化中遗留产物和重复序列的存在使基因的密度降低。如假基因、转座元件等。

2. 与染色体复制和分离密切相关的几个染色体结构是什么？各起什么作用？

A. 染色体复制：1）复制起始位点：DNA复制机器组装和复制起始的位点；2）端粒：它可以抵抗染色体重组和DNA降解，还可以作为染色体末端复制的特殊起点，保证染色体末端的完整性。

B. 染色体分离：1）着丝粒：DNA复制后染色体精确分离所必须，它指导动粒的形成，动粒跟着丝粒DNA和微管相互作用，拉动姐妹染色单体分离并进入两个子细胞；

2）纺锤体和微管组织中心：微管组织中心在细胞两侧形成“极”，微管解聚向两极拉动染色单体（纺锤体由微管组成），使姐妹染色单体分离；

3）黏粒：使染色体附着，当其被水解后，染色单体才能分离。 3. 核小体结构是如何组装的？

简言之，首先，H3和H4各两个形成一个四聚体，H2A和H2B则形成一个异源二聚体。H3和H4形成的四聚体和双链DNA结合后，使得DNA充分弯曲并维持该性状，然后募集俩个由H2A和H2B构成的异源二聚体结合，这样便完成了核小体核心颗粒的组装。核心颗粒再由连接DNA和H1组蛋白连接，形成完整的核小体结构。

H3·H4四聚体的组蛋白折叠区与147 bp DNA中的60 bp相互作用。H3的N端α螺旋与结合DNA末端的13 bp片段相互作用。H32·H42四聚体在核小体中占据关键位置，分别与DNA中部和两端结合，造成DNA高度弯曲和固定，使得DNA与H2A·H2B二聚体的结合相对容易。两个H2A·H2B二聚体分别与30 bp的DNA结合，这30bp的DNA位于与H3和H4结合的60 bpDNA的两侧，形成组蛋白八聚体的底端部分。组蛋白与DNA的小沟结合，组蛋白尾巴伸出核心结构之外，作为修饰位点。 4. 组蛋白的N端tail的作用有哪些？

1）组蛋白N端tail是30 nm染色质纤丝的形成所必须的，缺少N端tail的核心组蛋白不能形成30nm纤丝，这个尾巴最可能的作用是通过它与相邻核小体的相互作用稳定30nm纤丝。

2）tail上有很多高度修饰化的位点，可以参与基因表达调控。这些修饰包括Ser、Lys残基上的磷酸化、乙酰化和甲基化。组蛋白N端tail的修饰可改变染色质的易接近性。

5. 两种特殊染色体结构（灯刷染色体和多线染色体）分别是怎样产生的（同名词解释）？ 见名词解释12、13。

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6. 染色体复制过程中组蛋白的修饰状态在子代中如何维持？

在DNA合成，复制叉通过的时候，核小体八聚体解体，但其中H3×2+H4×2形成的四聚体并未解体，H2A·H2B二聚体也未解体，而是仍旧结合在子链DNA上而并不释放到反应池中，而H2A和H2B组成的二聚体则被释放到反应池中实现再次组装。结合在子链上的旧的组蛋白募集新的或旧的组蛋白成分实现核小体的组装，可以形成4种新的组合：1）全新；2）3/4旧，包括H3·H4四聚体和H2A·H2B及1/4的新组蛋白；3）全旧；4）1/4旧的H2A·H2B。旧的组蛋白可以募集相应的酶，对新的组蛋白进行修饰，且这种修饰使得新的组蛋白与旧的拥有相同的形式，保证了染色质状态的可遗传性。

四．Transposons & Retroposons

Ⅰ名词解释

1. Transposon 转座子，是一类可移动的DNA序列，它可以将自己（或自己的一个拷贝）插到另一序列中的某一位置，而它跟靶序列可能没有任何相关性。

2. Retroposon 逆转座子，基因组内存在通过DNA转录成RNA，再经逆转录成cDNA并插入基因组新位点中的序列称为逆转座子。转座过程是由RNA中间体介导的。

3. IS 插入序列，一类最简单的转座子，长度为1~2 kb，其两端有长约50bp的反向重复序列。其编码框可以编码转座酶，可以识别反向重复序列，催化自身发生转座。反向重复序列外侧为正向重复的靶位点重复，5-11bp,本身不属于IS，在IS插入新的位点时，旧的靶位点重复不与转座子一同转座，而是在新的位点形成新的靶位点重复序列。 4. Composite Transposons 复合转座子，是以IS组件为基础组成的一个复杂的转座单元。具有中央区域和两侧区域，中央区域是具有编码功能的基因，一般携带有药物抗性基因，两端以IS序列元件包围，IS插入序列可以自身作为一个单位转座，也可以复合转座子为单位转座。

5. Replicative Trnsposition 复制型转座，在复制型转座过程中，转座子本身被复制，它的一个拷贝留在原来的位点而另一个拷贝插入新的靶位点，使转座子的拷贝数增加，该过程用到转座酶和解离酶。

6. Nonreplicative Transposition 非复制型转座，非复制型转座子直接从供体位点移动到受体位点，供体位点在转座子离开后会产生双链断裂，这一过程仅需要转座酶。

7. cis-Preference 顺式优先，是IS编码的转座酶的共同特征，转座酶倾向作用于自身编码的DNA分子，即自身编码的转座酶只作用于自身的转座，不能结合其他DNA上的Tn10，以此机制可以有效的控制Tn10的转座频率。 8. Transforming viruses 转化病毒，指病毒感染宿主后，可引起宿主细胞发生遗传改变的病毒，包括RNA病毒和DNA病毒。

9. Transformation 转化，有2种含义：1指细菌或酵母通过外源DNA的加入而使其获得新的遗传标记的过程；2指通过某种方式使得动物细胞进入一种过度生长的状态，类似于细胞处于癌变环境。 10. Transfection 转染，指动物细胞通过外源DNA的加入而使其获得新的遗传标记的过程。

11. Transduction 转导，有2种含义：1.通过噬菌体将基因从一个细菌转入另一个细菌的过程；2.指逆转录病毒使真核细胞获得和转移DNA序列的过程。 Ⅱ 简答

1. Mu噬菌体的转座机制是什么？

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Mu噬菌体是一个大的DNA转座子，它有两种形式的转座。在溶源途径中，当它侵染宿主时，通过非复制型转座整合到宿主基因组上，而后续的溶菌途径中，其拷贝数的增加则是通过复制型转座。这两种转座，其转座子和靶基因的反应类型是相同的，而后续过程不同。简言之首先在转座酶的作用下，在供体转座子部位产生交错切割，同时在靶位点上也产生交错切割，然后转座子与靶位点连接，形成在复制型转座和非复制型转座过程中均可产生的共同中间体，之后若在复制叉结构上能够募集复制相关的酶，则使得转座子发生了复制，即为复制型转座；反之，则在供体位点上进一步产生第二次切割，则为非复制型转座，从而导致供体的DNA双链断裂。 2. Tn 10的转座频率控制机制是什么？

1）反义调节：过生成反义RNA来抑制转座酶的翻译，从而对其转座频率进行负调控。Tn10右侧IS10部位有两个启动子，Pin和Pout。由Pin起始转录，产生一个IS10全长的转录，可编码有活性的转座酶，从而完成Tn10的转座；由Pout起始转录，产物是一段短的反义RNA序列，这段反义RNA的5’端与转座酶的5’端互补，可以封闭其核糖体结合位点，阻止了核糖体的进入，从而抑制转座酶的翻译，控制转座频率；

2）甲基化调节：RNAP和转座酶更易与半甲基化状态的DNA序列结合，通过全甲基化来降低这种亲和力，因此转座只能发生在DNA复制后的一段时间内，复制完成后形成全甲基化就不能转座了。在Tn10的碱基序列中有两段GATC位点，通过对A的甲基化来实现调节。通过GATC甲基化，可将Tn10的自身转座和复制相偶联，使转座只发生在DNA复制后的一段时间内。

在第一个复制叉行进过后，这就造成GATC以一个暂时的半甲基化形式存在，此时RNAP和transposase对半甲基化序列的亲和性达到一个最高的活性，此时来发生转座；当复制完全完成之后，此时GATC变成全甲基化状态，此时RNAP和transposase的催化效率则会降低，进而限制转座；

3）顺式优先：转座酶仅能够作用于编码自身的DNA分子，完成自身的转座。单独增加转座子的拷贝数并不能增加转座的频率。两种假设：A转座酶被翻译后，倾向于结合邻近的DNA序列，该结合很紧密，很难扩散到其他地方，B只有当它和自身的DNA结合后，才能被稳定，才具有活性； 3. 玉米中的Ds元件怎样引起玉米表型改变？

通过对染色体断裂造成的表型改变：

1）对于一个杂合子来说，它表现为显性基因的特征，当在显性基因的所在的染色体上存在Ds基因时（Ds基因位于显性基因和着丝粒之间），当它进行转座后，由于其是非复制型转座，从而会使其所在的染色体断裂，这样造成显性基因丢失，细胞表现出隐性基因的作用，使得表型改变。

2）另一种情况，Ds基因位于基因和着丝粒同侧，当Ds基因转座时，会造成双链断裂，无着丝粒的部分丢失，而含着丝粒的部分会在断裂端发生融合，形成含有两个着丝粒的类似于桥的结构，该结构在细胞分裂过程中因两个着丝粒分别向两极移动，染色体在相反的作用的牵拉下发生随机断裂，这样由于断裂的随机性就会使得一些显性作用在一些细胞中消失，而且这种作用不断循环，这样就使得显性作用不断丢失，从而得到多种多样的表型。也称之为融合-桥-断裂循环。

4. 黑腹果蝇的杂交不育现象是什么，怎样产生的？

黑腹果蝇（D. melanogaster）的杂交不育现象是当P型雄性果蝇和M型雌性果蝇杂交的后代表型正常但不育。 (如果黑腹果蝇（D. melanogaster）的某些品系发生品系间杂交，子代会出现“劣生性”或退化性，产生一系列的缺陷，

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包括突变、不育、染色体畸变和有丝分裂分离异常等，这些相互关联的缺陷叫做杂交发育不全。)

产生机制： 果蝇可分为P型和M型，P型果蝇因其基因组含P elements而得名。P element实则是一个转座子，它末端有典型的反向重复序列，并且中间有三个ORF。它可产生两种转录产物，一种较短，另一种较长。在体细胞中是长的转录产物，剪接后保留了第三个内含子，而第三个内含子中有终止密码子，所以其翻译产物是一个短的蛋白质，为阻遏蛋白，可抑制P-element发生转座；而在生殖细胞中，其转录产物经剪接后将第三个内含子去除，从而可以翻译出较大的蛋白质产物，即为转座酶。所以仅在生殖细胞中，P element可以表达出具有活性的转座酶，从而在生殖细胞内可实现转座，而转座作用可以导致生殖细胞的基因发生断裂，最终导致生殖器官的发育缺陷，表现为不育。

杂交不育的方向性是如何产生的：因为P型雌性果蝇的体细胞可产生一种阻遏蛋白，可随着卵细胞发育保留在卵细胞中，抑制P element的转座。故杂交不育现象只有在染色体含有P element，而卵细胞细胞型为M型时即无阻遏蛋白时，才发生杂交不育。 5. 转化病毒是怎样产生的？

转化病毒，指病毒感染宿主后，可引起宿主细胞发生遗传改变的病毒，包括RNA病毒和DNA病毒。

首先，原病毒DNA整合入宿主DNA中，若在c-onc基因附近，借助于缺失，病毒基因组的env、LTR（right）缺失，c-onc基因同部分原病毒DNA序列融合在一起；接着，融合基因转录，转录产物的一端是病毒序列，另一端是细胞的c-onc序列；然后，经过剪接加工除去内含子，产生的融合RNA分子含有包装信号，如果细胞中存在完整的原病毒基因组（野生型病毒）产生的病毒RNA，融合的RNA分子和野生病毒的RNA分子可同时包装于同一病毒颗粒，且野生病毒的RNA分子和融合RNA分子之间发生重排，产生转化逆转录病毒基因组，其两端仍为病毒的重复序列。其重组频率在逆转录病毒感染期间很高，并且以多种形式进行。

6. Virus-like retroposon（类似病毒样的逆转座子）与LINE（长散布序列元件）的结构和转座机制的区别各是什么？ 结构：

1）类似病毒样的逆转座子的结构特点：250～600bp的正向末端重复序列（LTR）包围的蛋白质编码区，可编码反转录酶、整合酶等。2）LINE的结构特点：长度较长，6kb左右，有两个ORF，ORF1编码RNA结合蛋白，ORF2编码产物同时具有DNA内切酶和逆转录酶活性。 转座机制：

1）virus-like retroposon在转座过程中首先是转录出mRNA，然后以之为模板，通过逆转录形成双链cDNA，之后利用整合酶切割形成3’OH末端，并对靶位点进行交错切割，逆转座子与靶位点相互连接，转座过程中同样去掉两端的各2bp,最后完成切口补齐，完成了逆转座子插入靶位点。2）LINE：而LINE则首先利用ORF2合成的酶的内切酶活性将靶位点处进行切割，切割产生的一端可与LINE转录出的RNA进行互补配对，然后利用逆转录酶的活性以RNA为模板，以靶位点切口产生的3'OH为引物引发逆转录过程，直到LINE的RNA的全长完成逆转录，然后LINE的RNA发生水解，再以靶位点的另一端为引物，以刚合成的序列为模板继续进行合成，完成双链的合成，2个末端均产生靶位点重复，这样就实现转座。 7. 转座子在基因组进化过程中有什么意义？

答：转座子可通过转座作用使外显子重新组合而赋予其新功能的基因出现，这是生物进化的原始材料，是遗传多样性获得的一个重要途径；

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1） 由转座子介导的外显子的重组，可导致新的功能基因的出现； 2） 直接通过转座子的转座作用来实现外显子的重组； 3） 由逆转座子介导的外显子重组；

通过复制性转座使得基因产生重复从而有利于基因的进化（原有基因仍有作用，而新产生的基因可发生新的突变，从而获得新的性状，在进化过程中，产生不同的基因座）。

五．Cancer

I.名词解释

1. The two-hit hypothesis 双击假说，由体外实验证明提出的：如果试管培养的细胞被一个致癌基因转染时，细胞仍扁平有序，不会发生癌变，但若两个致癌基因同时转染时，形成转化细胞的聚焦点，导致肿瘤的发生，即肿瘤的发生是通过两个以上因素的“打击”来表现的。一般来说，转化这些初始细胞需要一个癌基因表达产物在核内起作用，另一个在细胞质中起作用，即肿瘤的发生需要至少两个因素的“打击”。

2. Gain-of-function mutations 功能获得性突变，把原癌基因变成了致癌基因。在正常细胞中存在原癌基因，是细胞生长发育所必须的（如某些生长因子），并且这些基因处于正常工作状态。当它们发生突变时，细胞具有了恶性增生的能力，很可能导致制癌细胞的发生，这种突变为功能获得性突变。

3. Loss-of-function mutations 功能缺失性突变，在正常细胞中存在抗癌基因，并且这些基因处于正常工作状态。当它们发生突变时，不再具有抑癌功能，很可能导致制癌细胞的发生，这种突变为功能缺失性突变。

4. Checkpoints 关卡、检查点，真核细胞周期的几个控制点，是细胞周期进行过程中进入下一个阶段前的停滞点，用以检测上一过程是否完全完成及条件是否合适，直到环境适合解除控制作用，关卡处的蛋白调控对细胞周期起至关重要的作用。

5. Tumor suppressors 肿瘤抑制因子，细胞中的抑癌蛋白，是细胞内抑癌基因所表达的基因产物，如p53蛋白，如果该蛋白失去或降低功能，伴随其它遗传因素的改变，细胞可能发展为癌细胞。

6. Adoptive cell therapy （ACT）过继细胞疗法，是现在较为有效地癌细胞免疫疗法，利用从自身获取的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）抑制肿瘤发生的方法。简要步骤是：将病人的肿瘤组织切除；并在体外与细胞因子共同培养一段时间，扩增T细胞；分离并筛选肿瘤浸润淋巴细胞TIL进行扩增，选择；然后回输到肿瘤病人体内，回输前需用CD3抗体是患者体内原有的T细胞失活；TIL在患者体内杀灭癌细胞。 II. 问答题

1. 肿瘤细胞具有哪些超凡能力？

答：1）不需要生长因子，自身即可以实现大量的扩增；2）对临近细胞发出的抑制信号不敏感；3）可逃避凋亡； 4）可无限扩增；5)可转移，可侵入到其他组织；6）持续的血管发生；7）可发生与癌症相关的炎症。 2. Normal & Transformed cell主要有哪些区别？ 区别有五：

正常细胞：1）扁平有序排列；2）接触抑制；3）培养时须加入生长所依赖的血清；4）有不同程度的贴壁现象；5）无致癌能力，转移到裸鼠的体表不会致癌。

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转化细胞：1）叠加无序；2）无接触抑制；3）不依赖生长因子；4）不贴壁；5）转移到裸鼠时会产生肿瘤。 3. 以膀胱癌为例，简述从肿瘤组织中克隆致癌基因的过程

答：膀胱中的一个基因ras发生突变为rasD，易产生膀胱癌，从其中克隆癌基因的过程如下： 1） 裂解膀胱癌组织细胞，提取DNA，并利用水解酶切割成约30～50bp的DNA片段； 2） 转染小鼠的3T3细胞系，进行培养；

3） 被转化的细胞在培养后则会与未被转化的细胞共同生长，因之增生较快，则会形成与正常细胞形态不同的“聚焦

点”；

4） 把被转化的小鼠3T3细胞分离出来，抽提DNA，并切割成约30～50bp的DNA片段，实现第二次的DNA转染

3T3细胞，这样即可以将人的非癌基因基本排除；

5） 抽提Focus DNA，并将之切割成一定大小的DNA片段，利用噬菌体作为载体，将其导入大肠杆菌，并涂板，实

现亚克隆（subclone）；

6） 利用人的Alu作为探针，来筛选含有突变DNA的噬菌体

4. 举例说明proto-oncogenes(原癌基因)转变为oncogenes（癌基因）的机制。

至少有四种机制：1）点突变或缺失或插入突变导致蛋白的高活性或持续活性（如Ras蛋白的激活，由于单碱基突变，导致其第12个氨基酸残基突变）；2）染色体易位导致两个基因融合产生融合基因，导致有持续活性的嵌合蛋白产生（人慢性骨髓白血病的产生，9号染色体跟22号染色体融合，最终产生bcr-abl，导致融合蛋白的产生，为一种Tyr蛋白激酶，对白血病的发生和发展十分重要）；3）染色体的易位使一个一条染色体的调节基因转移到另一条染色体基因上，从而改变了基因的表达水平，如将调节基因移到另一染色体上员癌基因附近使其高表达（人B肿瘤细胞的产生，Ig基因插入到c-myc的靶点，在Ig增强子的作用下，c-myc基因过量表达）；4）染色体DNA扩增使基因过表达（如某些神经母细胞瘤）。5）反式剪接产生融合mRNA和蛋白；6）机械力限制细胞表面受体的空间组织形式 5. 举例说明oncogenetic virus如何致癌。

Oncogenetic virus 按照核酸不同可以分为两类：DNA Oncogenetic virus和RNA Oncogenetic virus，其致癌机理并不相同：

A DNA肿瘤病毒都有癌基因，它的癌基因来源于自身，与宿主无关，是指导自身基因早期表达所必需的，致癌机理病毒表达的蛋白结合于宿主抑癌基因的表达产物，使之失活，即使宿主的抑癌基因失活。Rb是一种抑癌基因，以腺病毒为例，其致癌基因E1A基因的转化能力与RB蛋白的结合能力直接相关，即E1A基因与RB蛋白结合使RB失活，导致肿瘤的发生；

B RNA肿瘤病毒的癌基因来源于宿主，致癌机理是激活癌基因途径，激活细胞恶性增生的信号通路，最终导致癌症发生。以红白血病为例，在正常情况下，Epo与其受体正常结合而产生信号转导，当被一种逆转录病毒(spleen focus-forming virus，SSFV)感染后，该病毒表达的一种糖蛋白gp55可取代正常的Epo结合在受体上，这样即使细胞中没有Epo因子存在的时候，由于gp55的存在则可导致信号的过量表达，从而产生癌症 6. 简述RNA tumor virus携带v-onc的来源。

通过转导从c-onc得来的

当逆转录病毒插入宿主DNA的c- onc附近时，有可能通过基因重组而使逆转录病毒基因组发生缺失，这样部分

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缺失的结果使部分的病毒基因与c-onc发生融合，之后以之为模板进行转录，转录模板便带有部分病毒基因和部分c-onc基因，当该转录产物经过剪接加工后与另一野生型逆转录病毒的RNA同时被包装到一个病毒颗粒中时，这两种RNA分子则会在RNA水平上再次产生重组，结果产生的重组分子含有一个c-onc基因，称之为v-onc。 7. 举例说明Epigenetic mutations（表观遗传突变）对癌症的作用。

表观遗传突变在不改变基因型的基础上可以影响生物的表型，它包括DNA甲基化，组蛋白的修饰等。研究发现，肿瘤细胞在表观遗传水平上与正常细胞有很大的不同，且表观遗传突变可在一定程度上诱导肿瘤发生。

以DNA甲基化为代表的表观遗传修饰在肿瘤细胞中经常发生改变。通过对DNA甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA甲基化状态：正常情况下，抑癌基因启动子区的CpG岛是开放的，可启动抑癌蛋白的表达，抑制癌症的发生，但在癌细胞中，抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化处于封闭状态，导致这些抑癌基因无法转录，并且丢失了正常细胞的功能；同时，肿瘤基因组在重复序列有普遍的低甲基化，肿瘤特异性基因和印记基因也表现出低甲基化，这可能会导致肿瘤和印记丢失，以及基因组的不稳定。

麻醉剂、情绪稳定剂、化疗药物可去除甲基，对癌症治疗有效。 8. 为什么说Ras蛋白具有split personalities（人格分裂）？

人格分裂是指某人都多重性格，而对于Ras而言，是指它有多重功能： 1） 有促进癌症发生的倾向；2）也有抑癌的效应。

ras为原癌基因，其活化后能使鼠NIH/3T3细胞系转化为肿瘤细胞；但同时，Ras也有抑制癌症的作用：p53是重要的抑癌因子，当MDM2结合p53后，可以介导p53通过泛素化途径降解，而Ras则通过Raf、PI3K抑制MDM2的作用，帮助p53发挥抑癌作用，因此也具有抑癌效应。

所以说Ras既有致癌作用又有抑癌功能，它具有split personalities。 9. Chromosomal translocation如何致癌。

1）染色体易位使得表达融合蛋白，产生癌症。如Trk（一种RTK）与原肌球蛋白，在染色体易位时产生了一种N端来自原肌球蛋白、C端来自Trk的一种融合蛋白，这种蛋白可导致癌症的发生；

2) 染色体易位使得一条染色体的调节基因转移到另一条染色体基因上，从而改变了基因的表达水平；以Burkitt's lymphoma 为例。8号染色体上有原癌基因c-myc，在正常细胞中低表达；而在14号染色体上有免疫球蛋白重链的恒定区和可变区的基因CH和VH，当8号染色体和14号染色体经易位发生交换后，使得c-myc置于靠近重链恒定区基因CH的增强子区，从而导致c-myc基因的表达大大提高，导致癌症的发生；

3）通过染色体易位形成新的融合基因，以产生了新的融合蛋白，以费城染色体的形成为例，第9号染色体有ABL基因，22号有BCR基因，二者均为原癌基因，当两这条染色体发生易位则产生融合基因BCR-ABL，从而产生一个新的酪氨酸激酶，并且为组成性表达，最终导致CML，即人慢性粒细胞白血病。 10. 简述p53、RB及myc基因的功能。（求准）

p53基因是细胞内重要的抑癌基因，位于17号染色体p14区，~20bp,含有11个外显子，其编码蛋白是一种转录因子，也DNA结合蛋白，在细胞周期调节过程中发挥重要作用，现在发现p53是一个蛋白质家族，主要抑制细胞从G1期进入S期，与细胞的增生、分化和凋亡密切相关；p53对DNA损伤可作出应答，它可活化DNA损伤修复蛋白，进行DNA损伤修复，维持DNA的稳定性；p53对细胞凋亡也有诱导作用，但现在具体的机理还不清楚。

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RB基因（成视网膜细胞瘤）是细胞内重要的抑癌基因，定位于13号染色体q14区，~200bp,含有27个外显子，其表达产物是一种抑癌蛋白、DNA结合蛋白。约有10个磷酸化位点，低磷酸化时在细胞G1期作为细胞周期关卡，一旦高磷酸化，就失去checkpoint作用，以磷酸化和去磷酸化的形式来参与细胞周期的调控和细胞程序死亡，在细胞分化过程的起始阶段发挥关键性作用；可作为转录因子的辅助因子和接头蛋白来抑制细胞的增生，其在转录水平调节的最终结果可影响到细胞某些基因的表达，基因的稳定性；在细胞分化，衰老，死亡，血管增生中均起作用等，其突变和许多癌症的发生有关系。

myc：为原癌基因,其编码的蛋白具有多重功能。是一种转录因子，具有转化细胞的能力，并有与染色体DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中均发挥作用。它可促进染色质的修饰，诱导转录，可在复制起始水平、转录水平上以及翻译水平上来发挥作用（可通过募集HDAC或HAC进行染色质修饰，从而抑制或促进转录；促使mRNA帽子的甲基化；在DNA复制起始，决定DNA复制起始位点的起始频率与时间）。 11. 体内有哪些途径可能激活myc基因致癌？

myc基因编码产生的MYC蛋白是一种转录因子，具有DNA结合结构域，一般情况下，myc在正常细胞中低表达，若MYC在表达水平失去控制高表达，就会产生肿瘤。有以下几种方式可以导致myc失调： 1）逆转录病毒携带v-myc感染，转导产生v-gag-myc基因，可促进转化的正常组织、细胞有肿瘤发生； 2）大的遗传异常影响myc位点，包括逆转录病毒启动子或增强子的插入，染色体易位及基因的扩增； 3）激素或生长因子的活化，它们的受体，第二信使或转录效应因子集中对MYC表达的影响； 4）直接或间接改变稳定MYC mRNA或蛋白的机制也会激活myc基因致癌。 除了在基因水平，其他水平myc的改变也会致癌：

1） 染色体水平：可通过募集HAT、HDAT（组蛋白去乙酰化转移酶）使基因表达关闭； 2） 转录水平：与MAX在转录水平使某些特定的基因表达改变；

3） 细胞周期水平：在细胞周期过程中发生同源重组，使细胞周期重新进入，加速细胞周期； 4） 翻译水平：可诱导使mRNA甲基化； 5） DNA复制水平: myc的增多可能导致肿瘤。

12. 简述cancer和DNA damage以及Apoptosis的关系如何。

在多细胞生物体中，细胞的数量保持在一定的量上。这种平衡是通过有丝分裂的细胞增生以及由细胞凋亡引起的细胞死亡来实现的。如果这一平衡被打破，则有可能产生癌变。为了处理DNA损伤，细胞进化出一套复杂的修复系统，如果这套系统失败，则会导致基因组不稳定，进而在生理状态下引发细胞凋亡。如果关键的凋亡信号蛋白突变或者癌基因激活，则可能发生肿瘤。

进化中凋亡途径是保守的，抗凋亡蛋白如Bcl-2的过量表达会导致不适当的细胞存活，这与慢性淋巴白血病及其他癌症的发生也相关，促进凋亡的p53的失活液有相似的致癌效应。CD95信号与凋亡、组织生长和肿瘤形成有关，在肿瘤细胞中，FLIP过量表达，激活AKT、NF-kB、JAK的信号通路，导致肿瘤细胞增殖。 13. 为什么抽烟和黄曲霉容易导致癌症？

1）烟含有苯并芘，它可通过一系列的反应演变而修饰基因组中的G，使G易变成T而发生突变，从而导致癌症的发生；此外烟中的尼古丁是乙酰胆碱受体的一个兴奋剂，因此抽烟可以激活乙酰胆碱受体，从而通过该信号通路可

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导致细胞的增生并且抑制细胞的凋亡；同样它可激活其他的信号途径而发生癌变；

2）黄曲霉素可经过酶的催化而产生一个大的基团，来修饰基因组中的G，促使DNAP在G的互补位错误插入A，使原来的G≡C变成G≡A，从而使基因（如p53）发生突变致癌。 14. 导致基因组不稳定的主要原因是什么？其后果是什么？

1）端粒的丢失：其产生的原因是细胞在无端粒酶的情况下持续分裂，导致染色体间的融合，形成融合-桥-断裂循环，由于细胞分裂，染色体随机断裂，造成染色体的缺失与重复，使基因组不稳定；

2）双链末端的产生，其产生原因是由于DNA断裂未经修复，其中的DSB是最主要的因素，从而产生变异，导致基因组的不稳定；

3）染色体重排：染色体重排涉及到染色体的缺失、易位或重复，导致基因拷贝数的改变，增加基因组的不稳定性；基因组的不稳定在正常生理情况下会导致细胞凋亡，如果关键的凋亡信号蛋白突变，原癌基因的激活，或抑癌基因突变，则可能导致癌症的发生

15. 简述关于癌症发生的几个假说的内容，谈谈你自己的看法。

1）标准法则:是以结肠癌为例的致癌基因-抑癌基因突变模型，指发病符合多阶段，多基因（一般4~6个）突变累积的模型；

2）修正的标准法则：癌症发生早期，一个或多个DNA损伤修复基因突变，使每个细胞中积聚1~10万随机突变，致癌症相关基因发生突变。该理论认为癌症发病不是依赖4~6个特定基因的突变，而是由损伤修复基因突变导致的其他大量随机突变的积累；

3）早期不稳定理论：染色体不稳定性早期发生，对细胞复制起关键作用的控制基因突变或因表观遗传修饰失去功能，染色体将出现异倍体，导致若干癌基因或抑癌基因突变；

4）全异倍体理论：异倍体是癌基因最早发生的遗传变异，即使没有特定的基因突变，异倍体足以致癌。

所有的理论均需要扩展，它们只能解释一类或几类癌症的发生，不可能完全覆盖，因为癌症的发生是一个非常复杂的过程，即使是同一种癌症，突变的基因也未必相同，并呈现一定的个体差异，研究的过程中要考虑表观遗传的影响。后三种理论符合新的实验结果，并且有融合趋势。 16.治疗Breast cancer开发了哪些药物？

乳腺癌中呈现较多的HER（人表皮生长因子受体），可以分为4类，其中最主要的是HER2。因此在设计药物时，将HER作为药物靶点。

1）直接设计针对HER2的单克隆抗体：直接作用于HER2的抗体；2）设计阻止HER2二聚体的形成的抗体；3）抗体与具有细胞毒作用的药物共同作用，通过抗体将药物运输到作用位点来发挥作用；4）双/三特异的抗体：可以把具有细胞毒作用的细胞募集到作用靶点来发挥作用；5）通过设计抑制酪氨酸激酶活性的药物来实现治疗；6)设计热休克蛋白的抑制剂，来进一步控制HER2及下游信号蛋白的稳定性，从而达到治疗的目的；7）设计能识别HER2和VEGR及其他和癌症有关的元件的药物，通过一药多用的手段达到治疗目的；8）设计可恢复抑制肿瘤转移的药物来进行治疗。

赫赛汀（Herceptin）即人类的抗HER2单克隆抗体，它作用于乳腺癌细胞的HER2表面蛋白，干扰癌细胞的生物学进程，最终致其死亡。Dimercept也是一种治疗乳腺癌的药物，可以结合4中HER，阻止其形成2聚体，以达

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到治疗效果。

17. 简述HPV vaccine的原理。（宫颈癌疫苗） HPV的E6和E7直接和宫颈癌的发生相关。

E7可以和RB结合，从而抑制RB与E2F的结合，导致E2F的过量释放，使DNA大量复制，促使癌症的发生； E6可结合在p53上，导致p53降解，从而导致细胞的增生； 故可以此来开发HPV疫苗来抑制E6和E7的表达

使用多种疫苗的组合，如四价体疫苗，即HPV 6/11/16/18 L1类病毒颗粒疫苗。 18. 重新激活p53治疗癌症有哪些局限性？（求准）

p53基因是细胞内重要的抑癌基因，其编码蛋白是抑制细胞从G1期进入S期，活化DNA损伤修复蛋白等，是一种重要的抑癌蛋白。在许多癌症中都发现了p53的突变，因此，可以设计重新激活p53以达到治疗癌症的目的。目前的方法主要有2种：1）设计药物重新激活突变的p53蛋白；2）通过抑制MDM2来活化p53。

但最近有报道称，在K-Ras催发的肺癌中，p53只在癌症晚期发挥抑制作用，这意味着，尽管这种方法可以诱导恶性肿瘤的产生，但p53的再活化无法在早期抑制癌症发生。

六．HIV

I.名词解释

1.TAR RNA :是HIV-1 的一个顺式作用元件，处在+1~+59的位置，是一段RNA。是自身转录出来的前59个核苷酸形成RNA增强子，可形成特征性的茎环结构被tat结合来发挥作用。

2.“ADIS cocktail”therapy：艾滋病鸡尾酒疗法，原指高效抗逆转录病毒治疗（HAART），由美籍华裔科学家何大一提出，是通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病的一种方法。该疗法可减少单一用药产生的抗药性，最大限度地抑制病毒的复制。

3. NRTI&NNRTI：核苷逆转录酶抑制剂，是合成HIV的DNA逆转录酶底物脱氧核苷酸类似物，在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性的和HIV逆转录酶（RT）结合，抑制RT的作用，阻碍前病毒的合成，如ddC，ddI；

非核苷逆转录酶抑制剂，作用机理是通过与逆转录酶的非底物结合部位结合通过别构作用而抑制HIV逆转录酶的活性。 II.问答题

1.简述HIV-1 structural proteins的类型(9种)

答：基质蛋白，衣壳蛋白，核衣壳蛋白，蛋白水解酶，逆转录酶，整合酶，膜表面蛋白，跨膜蛋白，病毒颗粒蛋白2.简述HIV-1nonstructural proteins的类型

答：病毒感染因子，HIV-1特异病毒蛋白，转录反式激活因子，病毒蛋白质表达调节因子，负效应因子 3.简述HIV-I感染和侵入宿主细胞的过程

答：1）HIV-1表面的gp120特异的结合于宿主细胞表面主要受体CD4上；2）gp120结构改变，继而结合于辅助受体CCR5/CXCR4；3)gp41结构改变，接触宿主细胞膜并拉近HIV-1包膜和宿主细胞膜使二者融合，衣壳-基因组进入细胞质

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4.为什么说HIV-I是最复杂的逆转录病毒之一

答：因为它的基因组共有9个基因，长度约9.2kb。除了逆转录病毒自我复制必须含有的Gag、Pol、Env三个基因外，还有六个调节基因：tat、rev对基因表达是必须的；nef、vpu、vpr、vif对基因的表达不是必须的。该六个基因通过编码蛋白质来发挥作用

其中最重要的是Tat（转录反式激活因子）和Rev（病毒蛋白质表达调节因子），分别可以增强转录以及介导mRNA细胞质转运。

5.HIV-1 LTR 中有哪些顺式作用元件?

答：启动子：TATAbox、IST、GCbox，主要集中在-1~ -78处；增强子：-454~-78；

TAR element：+1~+59，是一段RNA，是自身转录出来的前59个核苷酸形成RNA增强子，被tat结合 6.简述HIV-1 Tat和Rev protein 的功能 答：对基因表达式必需的

tat：Tat蛋白结构域的功能分为结合与激活两方面。Tat蛋白是序列特异的RNA结合蛋白，它的结合位点是HIV转录产物5’端附近的TAR元件。在转录水平上增加HIV-1的基因表达，通过募集cdk9、cyclinT等来使转录顺利进行，在转录延伸阶段具有抗终止作用，在起始阶段有促进作用。此外可阻止在HIV-1形成的双链DNA整合后产生RNA再发生逆转录，有利于下一代病毒颗粒的产生；

Rev：RNA结合蛋白，可结合RRE序列。介导HIV-1编码的未经剪接的全长mRNA及部分剪接的较大片段RNA顺利通过核孔输送到细胞质中

7.简述HIV-1Net、Vpu、Vif和Vpr protein的功能 答：对基因的表达式非必需的

Nef：致病因子，导致ADIS的症状的发生，有效的增强HIV的治病能力； Vif：增加HIV-1病毒的感染能力；

Vpr：帮助经过逆转录后还未整合的双链DNA进入细胞核； Vpu：可以增加子代病毒颗粒的释放 8.为什么HAART需要联合使用更多的药物 答：HAART高活性抗逆转录病毒治疗

因为HIV病毒的变异速度太快，单一使用药物容易产生抗药性 9.为什么非洲猴被SIV感染后不会患AIDS

答：因为猴子体内有一套特殊的抗病毒系统，独立于免疫系统的抗体以及白血球以外，有效地保护动物免遭某些特殊病毒的入侵。

1）猴子细胞内存在大量蛋白质TRIM5-α，当HIV进入细胞后，能阻止HIV的衣壳脱落，阻止病毒扩散； 2）A3G可以使负链DNA的C脱氨基变成U，从而破坏了HIV-1在猴体内逆转录造 10.为什么以gp120和？gag亚单位为免疫原的AIDS疫苗遭到失败 答:1）病毒基因组发生的突变太快，而人产生的抗体太慢； 2）Gp120的表位不是线性表位，而是构象表位，难以确定

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gp120的表位是构象表位，不是线性表位。在HIV-1和CD4+细胞发生膜融合的过程中，gp120和gp41经历了一系列构象变化，形成很多融合中间物，其构象表位难以确定。

HIV-1感染几周后才出现抗体，这些抗体只能对几周前的HIV1-起作用，因此无效。

以gag为免疫原的疫苗用腺病毒5型做载体，在疫苗试验过程中，具有高水平Ad5抗体的受试者在接种了艾滋病疫苗后变得更容易感染HIV。 11.简述研制AIDS疫苗的历史和现状

答：历史上艾滋病疫苗的发展经历了两次高潮，其间有些重叠，第三次高潮才刚刚开始。在第一次浪潮中，科学家们遵循成功研发了乙肝疫苗的路径：找出病毒引发中和抗体的部分(称为抗原)，纯化后将其制成能在人体内引发类似抗体的免疫原。

之后出现的证据表明，这种方法没有效果。第二次艾滋病疫苗研发高潮始于1995年，其标志为将疫苗开发的着眼点从抗体转移到免疫系统的另一个方向——细胞免疫(CMI)方面。抗体能够帮助免疫系统在机体被病原体占领之前就阻断病原体感染。CMI则利用T细胞将体内已经被病原体感染的细胞杀灭。一些研究人员希望这种能激活CMI的候选疫苗可以保护机体免受HIV感染。而另一些研究人员的目标则更现实：只要接种后能降低感染者体内的循环病毒总数(即病毒载量)即可，这样就能延缓疾病的产生和降低传染性。目前，上临床的接近30种AIDS候选疫苗几乎均是以刺激CMI反应为目标而设计的，研究人员已经达成了一种共识——我们在这个方向上已经走的过远了。 默克公司的CMI候选疫苗曾被认为是临床疫苗中最有前景的候选疫苗，2007年9月，该疫苗在IIb临床试验阶段被宣布失败，这可被看作是第三次高潮的开始。目前，业界将目光更多地聚焦于寻找阻碍艾滋病疫苗发展的关键问题上。为了对潜在的基础知识及其与免疫系统相互作用的情况有更好的了解，从这些正在进行的研究中不难看出，第三次研究高潮更加注重解决HIV的中和抗体问题。但一种仅诱导抗体的疫苗还不够；对其它逆转录病毒预防和控制方面的研究提示，中和抗体和CMI应答二者均是不可或缺的。因此，CMI途径仍需继续加强研发。 12.简述HIV的起源

答：关于人类免疫缺陷病毒（HIV）的来源有很多种说法，归纳起来主要有三类，这就是所谓的自然说、医源说和人为说。自然说认为，HIV是自然演变而产生的，因偶然的机会感染了人类。其中比较流行的观点是HIV来源于非洲的黑猩猩。医源说认为，人类在生产小儿麻痹疫苗时，使用了被HIV或类似HIV病毒污染的黑猩猩器官组织，人在疫苗接种时被感染。人为说的观点不够统一。有人认为HIV是基因工程带来的灾难，还有人认为HIV是生物武器或某些人企图进行种族灭绝、建立“世界新秩序”的产物。

七．Genetic engineering

什么是穿梭质粒？

答：人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记的质粒载体，既可以在原核生物中复制，又可以在真核生物中表达，具有克隆与表达的双重功能。 粘粒的结构特点及优越性？

答：结构特点：是含有λ噬菌体COS位点（粘性末端）的质粒？？

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优越性：高效的转染效率；能够包装外源基因的容量较大，可达45kb 病毒载体的种类及各自特点？ 答：1）逆转录病毒载体：

优点：宿主细胞广泛；能高效的感染分裂细胞，感染率高达100%；外源基因完全整合到宿主细胞染色体上 缺点：不能感染非分裂的细胞；可能产生具有复制能力的病毒；由于随机整合，可能会引起“插入突变”；包装外源DNA的能力有限，小于8kb；要求靶细胞表面要具有逆转录病毒的相应受体。

2）慢病毒载体：属于逆转录病毒的一个亚类；有复杂的基因组，并且存在核定位信号序列，能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞。 3）腺病毒载体：

优点:人类是腺病毒的天然宿主，所以比较安全；该病毒在体外比较稳定，易于制备与纯化；宿主范围广，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞；腺病毒载体可插入35kb的外源基因，容量较大；腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，整合突变致癌可能性小。

缺点：它几乎可以感染所有的细胞，因此缺乏特异性；因不能整合到宿主染色体上所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予载体制剂治疗；因可能刺激免疫反应，使反复治疗的效果会逐渐降低 4）腺相关病毒载体：高度特异性整合

优点：目前尚未发现该病毒在人体中致病，所以比较安全；感染宿主细胞广泛，包括非分裂细胞和分裂细胞，特别是能够感染神经元和神经胶质细胞；能特异整合于人的19号染色体长臂末端，减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定

缺点：难以大量生产，复制需要辅助病毒，并且包装外源基因的能力有限，小于5kb 什么是STS,EST,contig？

答：STS:序列标签，指在一个文库中已知序列的DNA片段，大多数为基因。

EST:表达序列标签，是一种特殊的STS,特指经过表达所产生序列已知的DNA片段（从一个随机选择的cDNA 克隆中，进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列。EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。） Contig：一系列相互重叠的克隆，表示的是连续基因组的不同片段。 cDNA文库的构建？

答：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，在体外经过逆转录过程产生出双链cDNA，然后再克隆到载体中，转化受菌体，经过繁殖扩增，就形成cDNA文库 如何实现一个外源基因在体外表达? 答:

核酸的分离和纯化

1.分离纯化核酸的一般原则是什么？

答：（1）保持核酸一级结构的完整性，一级结构决定了遗传信息和高级结构及与其生物大分子的结合方式。细胞内存在的很强的核酸酶会把核酸降解，此外化学因素也可以降解核酸，另外机械剪切力和温度等也能使核酸降解，这

26

些都是分离纯化核酸时应该注意的。

（2）要达到一定的纯度，控制有机溶剂、金属离子等化学物质和蛋白质、糖类、脂类等生物大分子以及其他核酸的含量，通常情况下是越低越好，但是也要实验目的的不同而变化。

2.简述酚/氯仿抽提核酸的基本原理。

答：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加除去蛋白质杂质的效果。酚可有效地变性蛋白质；氯仿可使蛋白质变性并有助于有机相与水相的分层，去除植物色素和蔗糖；加入少许异戊醇的目的是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。可加入0.1%的8－羟基喹啉，是一种抗氧化剂，可防止酚被氧化而无效，另外其黄颜色有助于方便地识别有机相。

3.简述乙醇沉淀核酸的基本原理。

答：乙醇沉淀是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na之类的平衡离子能够与这些带点基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。

4.脉冲场凝胶电泳的原理是什么？

答：pulsed-field gel electrophoresis(PGGE)，其工作原理：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。

5.OD260/OD280的意义?

答：OD260/OD280的值：DNA＝1.8，RNA=2.0; 若>1.8，RNA尚未除尽；

若<1.8，样品中污染有蛋白质或酚。

6.双链DNA的稳定性如何？

答：双链DNA是非常惰性的化学物质。它潜在的反应基团隐蔽在中央螺旋内，并经氢链紧密连接，碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层保护，这种结构和保护，使得DNA比大多数细胞内其他成分保存的时间更长。

尽管双链DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的。高分子质量DNA长而弯曲，易受到最柔和的流体剪切力的伤害。由吸液、震荡、搅拌所导致的水流对粘滞的盘绕物产生拖拉力，都能切断DNA。

7.细菌染色体DNA与质粒DNA结构上的区别？ 答：

NA ×103kb) 27

＋

构 分子，破菌后被剪切为双链现状分DNA超螺旋 ，双链分离成无规则状 链，缠绕细胞碎片而沉淀 双链不分离 构或单链缺口双链结构，严重损伤的断8.为什么RNA不稳定？如何避免RNA降解？

答：因为核糖残基在2‘和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶切割。 RNA酶的链内二硫键使其可抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速折叠。

和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被难以被缓冲液中的EDTA或其它金属离子螯合剂失活。

RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，人体的汗液以及唾液中、环境中的灰尘、各种玻璃器皿和试剂，均存在RNA酶。

八．基因工程中的工具酶 I.名词解释

同裂酶（isoschizomer）：识别序列相同而来源不同的一类限制酶，统称为同裂酶，它们的切割DNA的方式可以相同，也可以不同。

同尾酶（isocaudamers）：识别序列不同，可以产生相同的粘性末端。

星号活性：指限制酶在一定的因素作用下酶切识别的特异性降低的现象。星号活性的出现会导致酶切位点的增多、片段增多。星号活性的引起与多种因素有关，如甘油浓度、其它有机试剂的存在、pH值或离子强度不适及有的酶本身容易出现星号活性。 II.问答题

1.使用工具酶应注意什么？

答：（1）保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml，对维持酶在反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V）是一种很好的可加入酶反应液的中性蛋白质，它的使用终浓度应该为0.1mg/ml。 （2）提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应该尽量使反应在接近Km的条件下进行。 （3）应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度和离子强度。 2.简要介绍反转录酶（活性和种类）。

答：反转录酶是由反转录病毒编码合成的。当病毒RNA包装成病毒颗粒感染新的细胞时，反转录酶的作用是将病毒RNA基因组复制成DNA以便于病毒基因整合至宿主基因组中。 反转录酶有两种活性：

DNA聚合酶活性――在病毒的生活周期中，反转录酶只是以RNA为模板进行复制，但是用在实验中，它以同样的效率以单链RNA或单链DNA为模板进行转录复制。

RNaseH活性――核糖核酸酶，其作用是从RNA-DNA杂交双链分子上降解RNA。

28

3. 反转录常用引物？

答：寡核苷酸脱氧胸苷（oligo(dT)）,模板3’端的序列有可能被过量拷贝，从而在cDNA中所占比例过大，这取决于反转录酶的质量及反应条件。

随机序列的寡核苷酸，旨在使用序列极为多样的一个寡核苷酸集群，以期至少有一些寡核苷酸与模板退火并作为反转录的引物；

特定序列的寡核苷酸，作为合成与某一段特定的mRNA相对应的cDNA的引物。 4. 连接反应的一般原则是什么？

答：为了获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般10μl；

连接反应中，载体和插入的目的片段的摩尔比一般为1：1或1：3。DNA浓度约为10ng/μl。 九．基因工程 I.问答题

1.什么是穿梭质粒？

答：所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。

2.黏粒的结构特点及优越性？

答：黏粒英文cosmid，指带有黏端位点(cos)的质粒。黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨卡青霉素抗性标记、cos位点。 黏粒有4个特点：

①具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。

②具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。

③克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可达45 kb左右。 ④能与有同源序列的质粒进行重组。 3. 病毒载体的种类及各自特点？

答：逆转录病毒载体：逆转录病毒是一种RNA病毒，基因组大小在8～11kb之间；逆转录病毒基因组RNA在逆转录酶的作用下逆转录出双链DNA，双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上，随着寄主细胞的复制而复制。 优点：宿主细胞广泛；能高效感染分裂细胞，感染率高达100％；外源基因完全整合到宿主细胞染色体上。 缺点：不能感染非分裂细胞；可能产生具有复制能力的病毒；由于随机整合，可能会引起“插入突变”；包装外援DNA能力有限，小于8kb；要求靶细胞表面要具有逆转录病毒的相应受体。

慢病毒载体：慢病毒属于逆转录病毒的一个属，同一般的逆转录病毒相比，慢病毒能够有效感染并整合到分分裂细

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胞和最终分化的细胞。

腺病毒载体：腺病毒为线性双链DNA病毒，基因组为30~36kb；病毒DNA并不整合到宿主细胞染色体上，而是以染色体外成分存在；目前应用较为广泛的是Ad5。

优点：人类是腺病毒的天然宿主，所以比较安全；该病毒体外稳定，易于制备与纯化；宿主范围广，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；腺病毒载体容量大；腺病毒无需整合到宿主细胞基因组中，整合突变致癌可能性小；

缺点：它几乎可以感染所有细胞，因此缺乏特异性；因不能整合到宿主染色体上，所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予制剂治疗；因可能刺激免疫反应，使反复治疗的效果会逐渐降低。

腺相关病毒载体：为单链DNA病毒，基因组在4.7～6之间，他的复制依赖于辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒；腺相关病毒位点特异性整合，能高效整合到人类19号染色体的特定区域。

优点：目前尚未发现该病毒在人体中致病，比较安全；感染宿主细胞广泛，包括非分裂细胞和分裂细胞，特别是能够感染神经元和神经胶质细胞；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减少了突变的可能性；外源基因表达稳定；

缺点：难以大量生产，复制需要辅助病毒，并且包装外源基因的能力有限。 4. 什么是STS,EST,contig？

答：STS是序列标记位点（sequence-tagged site）的缩写，是指染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片断，一般长200bp－500bp。它可用PCR方法加以验证。将不同的STS依照它们在染色体上的位置依次排列构建的图为STS图。在基因组作图和测序研究时，当各个实验室发表其DNA测序数据或构建成的物理图时，可用STS来加以鉴定和验证，并确定这些测序的DNA片段在染色体上的位置；还有利于汇集分析各实验室发表的数据和资料，保证作图和测序的准确性。

STS（Sequence-Tagged Site, STS）序列标签位点 是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA 序列，，用于产生作图位点，即测定一系列STS 的次序即可作出基因组区域的图谱。STS主要包括简单重复序列（Simple Sequence Repeat Polymorphisms, 简称SSR或SSRP）、锚定简单重复序列（ Anchored Simple Sequence Repeats, ASSR）、序列特异扩增区域（Sequence-characterized amplified regions）、酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS）、单引物扩增反应（Single Primer Amplification Reaction, SPAR）等标记技术。

EST是表达序列标签（expressed sequence tag）的缩写，在人类基因组测序工作中，有一个区别于\全基因组战略\的\战略\，即只测定转录的DNA序列。此时，须从cDNA文库中获取一些长为300－400各碱基序列作为表达序列标签，其作用相当于全基因组测序时的序列标记位点（STS），即可用来验证和整理不同实验室发表的cDNA测序资料。两端又重叠序列的EST可以装配成全长的cDNA序列。特定的EST序列有时可代表特定的cDNA。 contig就是重叠群的意思。就是基因组分析测序中的一个概念。

把含有STS序列标签位点的基因片段分别测序后，重叠分析就可以得到完整的染色体基因组序列。分析中的用到的一个概念就是重叠群。

物理图谱的制作，可以更好的理解这个概念：

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基本原理是把庞大的无从下手的DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作为图距，以DNA探针的STS（sequence tags site）序列为路标。1998 年完成了具有52,000个序列标签位点(STS)，并覆盖人类基因组大部分区域的连续克隆系的物理图谱。构建物理图的一个主要内容是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的“片段重叠群（contig）”。用“酵母人工染色体(YAC)作为载体的载有人DNA片段的文库已包含了构建总体覆盖率为100%、具有高度代表性的片段重叠群”，近几年来又发展了可靠性更高的BAC、PAC库或cosmid库等。 6.cDNA文库的构建？ 答：

张俊武

病毒、原核生物及真核生物基因组 第一节

基因组和基因的一般概念

基因组：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和称为基因组（genmome）。 人类基因组包含细胞核中的24个线性DNA分子以及胞浆线粒体上的遗传物质。 基因组的结构：主要指不同的DNA功能区域在DNA分子中的分布和排列情况。 基因：

经典概念：按照经典的遗传学概念，基因是控制生物性状的遗传物质的功能和结构单位。

一般概念：基因是携带一定遗传信息的特定DNA片段，它可以通过转录和翻译等过程表达具有一定生物功能的多肽链或转录出在蛋白质生物合成过程中起重要作用的tRNA和rRNA及其它RNA。

最新概念：基因是合成多肽或RNA顺序所必需的完全核酸顺序。一个基因不仅包含编码蛋白质或RNA的核酸顺序，而且包括获得一个特殊的初级转录物所需的全部顺序。

操纵子：operon, 在细菌中，一些功能相关的酶的基因常一个紧接一个的串联排列，受同一操纵区控制，这种由多个结构基因及其共同的转录操纵区组成的单一转录单位称作操纵子。 顺反子：cistron, 及结构基因，为编码一个多肽的遗传单位。

多顺反子：polycistronic, 多顺反子见于原核生物（但原核生物也有单顺反子作用单位），意指一个mRNA分子编码多个多肽链，这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点。

单顺反子：monocistronic, 多见于真核生物，一个转录完毕的mRNA内含有外显子和内含子对应的转录产物，经剪接后，该mRNA只编码一条多肽链。

简单转录单位：产生单一多肽的单一类型的mRNA的真核基因称简单转录单位。

复杂转录单位：被复杂转录单位编码的初级RNA转录物能够通过使用不同的切接位点或poly(A)位点以多于一种方式加工，导致包含不同外显子的mRNA。 第二节

病毒基因组结构的一般特点及部分重要的病毒基因组

病毒基因组的一般特点？

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1. 不同病毒基因组大小相差较大

2. 病毒基因组可由DNA组成，也可以由RNA组成

3. DNA病毒的基因组均由连续的DNA分子组成，多数RNA病毒基因组也由连续的核糖核酸链组成，有些以不连续的核糖核酸链组成。 4. 常见基因重叠现象

5. 重叠基因虽然RNA顺序大部分相同，但是转录成的mRNA的读框不同，因此产生的蛋白质分子往往大不相同 6. 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有很小的一部分不编码蛋白质

7. 有些病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质基因往往丛集在基因组的一个及几个特点部位，形成一个功能单位或转录单元，它们可被一起转录成含有多个mRNA的RNA分子，然后加工成各种蛋白质的mRNA模板。 8. 除反转录病毒基因有两个拷贝外，至今发现的病毒基因组都是单倍体。 9. 噬菌体基因的编码区都是连续的，而多数真核细胞病毒基因的编码区常不连续。 理想的基因工程载体应该具备什么要求？

1. 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力 2. 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好

3. 容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 4. 容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作

5. 有容易被识别筛选的标记，当其进入宿主或携带外来核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。 常见的基因工程载体有？ 1.

质粒载体：质粒是独立于细菌或细胞染色体外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的双链共价

闭合环状DNA分子。现在分子生物学使用的质粒载体都已经不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。如最常用的pUC19，复制起始经过改造能够高频启动复制和增加拷贝数；携带一个抗氨苄青霉素基因用于转化后筛选；携带细菌lac操纵子中的lacI和lacZ基因，通过蓝白筛选法挑选阳性克隆。

除了常用的大肠杆菌质粒载体外，还有人工构建的酵母、植物等质粒载体。还有不止一种ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的穿梭载体。 2.

噬菌体：噬菌体是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌体和Ｔ噬菌体；有的

则较小，如Ｍ13噬菌体。

Ｍ13噬菌体是一种大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组是单链闭环ＤＮＡ，其最大优点是：在用作克隆载体时可产生仅含外源ＤＮＡ某一条链的ＤＮＡ分子。这种单链ＤＮＡ分子可作为模板用于ＤＮＡ测序、制备ＤＮＡ探针或利用寡核苷酸进行定点突变。

λ噬菌体的基因组是长度为５０kb的线状双链ＤＮＡ分子。λ噬菌体是最早使用的克隆载体之一，常用于构建基因组文库和cＤＮＡ文库。 3.

动物病毒：质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核ＤＮＡ重组需要。感染动物的病

毒可改造用作动物细胞的载体，一般制作成穿梭载体（细菌中繁殖和克隆，然后引入真核细胞）。目前常用的载体

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改造自SV40、逆转录病毒和昆虫杆状病毒。 几种重要的病毒基因组？ 1．

乙肝病毒：Hepatitis B Virus，HBV基因组是一环状的部分DNA双螺旋结构，长约3.2kb，其中约

三分之二为双螺旋。长链为负链（与病毒mRNA互补），短链为正链，短链长度视病毒而异。 2．

逆转录病毒：retrovirus，病毒颗粒内基因组由两条相同的单股正义RNA组成，故反转录病毒为双

倍体；逆转录病毒RNA5’端有帽子结构，3’有poly(A)尾；基因组RNA的一部分与一个特异的宿主tRNA成碱基配对，此tRNA起始DNA合成。 第三节

细菌基因组简介

大肠杆菌基因组的特点？ 1． 2． 3． 多拷贝的 4． 5． 6． 7．

编码顺序一般不会重叠，这有别于病毒基因组 在DNA分子中具有多种功能的识别区域 在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止序列

细菌基因组中存在着可移动的DNA原件，插入序列（IS）和转座子（transposons）。 仅由一条环状双链DNA分子组成，具有紧密的遗传组成，基因间隔很小 基因组中只有一个复制起点，具有操纵子结构。

大多数情况下，编码蛋白质的结构基因在细菌染色体中是单拷贝的，但编码rRNA的基因往往是

质粒的一般性质？ 1． 2． 3． 4． 5． 第四节

真核生物基因组 独立而依赖

绝大多数质粒都是环状超螺旋DNA分子 质粒可以转移

质粒具有不同的复制能力 质粒的不相容性

真核生物基因组的总体特征？ 1. 2. 3. 4. 5. 6.

真核生物基因组远大于原核生物，也比较复杂 基因组中常具有许多复制起点

基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内 基因组中不编码区域远多于编码区域 真核生物的转录产物一般为单顺反子

高等真核生物的大部分基因有内含子，基因编码区是不连续的

33

7. 8. 9.

未发现核基因组中基因编码区重叠，但发现基因内基因 存在大量重复次数不等的重复序列

存在一些可移动的DNA元件。这些元件的移动多被RNA介导（逆转座子），少数也有被DNA介

导的（DNA转座子）。

真核生物DNA的分类？ 1.

编码蛋白质的DNA：

单基因（solitary genes）

基因家族中的重复基因和歧化基因 2. 3.

编码rRNA、tRNA、snRNAs和组蛋白的串联重复基因：

特殊非编码DNA：miRNA、siRNA、piRNA、反义RNA等等。它们通过RNA干扰、基因共抑制、

基因沉默、基因印迹和表观遗传学控制等调节基因表达。 4.

重复DNA（冗余DNA）：包括

简单顺序DNA

散布于基因组的重复子（移动的遗传元件） DNA转座子 LTR逆转座子

非LTR逆转座子（LINEs、SINEs）

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5. 第五节

为分类的间隔DNA（功能未知）

真核基因转录调控概述

有那几个环节可以调节细胞中蛋白质的终浓度？

无论在真核还是原核细胞，初始转录物的合成、转录后加工、RNA的降解、多肽链的合成、多肽链的修饰及加工和蛋白质的降解都可以调节细胞中蛋白质的终浓度。÷

在真核生物中，RNA从细胞核向胞浆的转运过程也是调节细胞内蛋白质浓度的重要环节。 原核生物基因表达调控的总体特点？ 1. 2. 3. 4. 5.

尽可能最佳化

真核生物基因表达调控的总体特点？ 1. 2.

表达调节比较复杂

真核生物的RNA聚合酶有三种（polI、II、III），分别催化18S和28S-rRNA前体（45S-rRNA）、表达调节相对比较简单

细菌中仅存在一种RNA聚合酶，起始转录不需要其它因子的协助 许多基因都是以操纵子为基础进行调节的 包括正、负两种调节方式

原核生物基因表达调节的明显目的主要是使单一的细胞适应营养环境变化以便细胞的生长和分裂

mRNA、5S-rRNA和tRNA的转录，RNA聚合酶必须在一般转录因子的帮助下才能催化转录起始。 3. 4. 5. 6.

存在正、负两种类型的调节，但是以正性调节为主 转录的活化与转录区的染色质结构变化有关

发生在细胞核的转录与发生在胞浆的翻译之间的有形分离

虽然适应环境变化也是真核生物基因表达调节目的的一部分，但是其最终目的似乎是为了实现能

作为胚胎发育及组织分化基础的一个遗传程序的调节 处于活化状态的染色质常具有的特征是？

DNA低甲基化，核小体核心组蛋白高乙酰化，特异组蛋白变异体和HMG蛋白结合的增多，DNase I高敏位点的出现（代表了局部核小体结构更为开放或核小体结构消失），转录因子结合到基因启动子区以及RNA聚合酶II和一般转录因子的募集和前起始复合物的形成。 什么是顺式作用元件？常见的有？

顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。顺式作用元件是指与结构基因连锁并能调节基因转录的DNA序列，如启动子、增强子、沉默子、隔离子、基因座控制区等等。

启动子（promotor）是指能与转录装置结合并能准确有效的起始转录的特定DNA序列。

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增强子（enhancer）是指在真核生物基因上游或下游常存在能增强基因转录的特异DNA序列。

基因座控制区（locus control region）是指染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。在转基因实验中,其调控作用可使基因表达对整合位点不敏感,而仅仅取决于转基因的拷贝数。

沉默子（silencer）是指能与基因连锁的能减弱基因转录的特定DNA序列。特异结合蛋白也沉默子的特异结合可能是减弱基因转录的重要环节。

隔离子（insulator）原指当放到增强子和启动子之间时能阻塞增强子作用的DNA序列，隔离子似乎也可能抑制染色体修饰的散播。

什么是反式作用因子？常见的DNA结合域有？

一些与顺式作用元件相互作用并调节基因转录的蛋白质分子称为转录调节蛋白或转录因子，也成反式作用因子。编码反式作用因子的基因与被反式作用因子调控的靶序列(基因)不在同一染色体上。反式作用因子有两个重要的功能结构域：DNA结合结构域和转录活化结构域。主要的DNA结合域包括：

螺旋－转折－螺旋（HTH）及同源结构域：绝大部分原核生物调节蛋白属于HTH，HTH是一个20个氨基酸残基组成的区域，包括两个α螺旋，一个处于DNA的大沟，称为识别螺旋；许多真核生物的转录调节蛋白也包含HTH结构，如同源异形蛋白（homeodomain,HD），HD由60个氨基酸残基组成。

锌指（Zn-finger），锌指是某些蛋白质分子中由若干保守的氨基酸残基同锌离子结合，形成相对独立的“指”状四面体结构。CXHY中的XY表示与Zn配位结合的半胱氨酸的组氨酸。

亮氨酸拉链（leucine zipper），有这种结构的蛋白质常以同源二聚体或异源二聚体的形式与DNA结合。这些蛋白的结合区可以分为两部分：一为碱性区（结合区），它与DNA结合，此区含有许多具有亲水性的氨基酸；与碱性区相连的是7个一套的氨基酸残基连续排列，每第七个都是疏水的亮氨酸残基。二聚体的形成对与DNA的结合是必要的，但结合的不是拉链区而是碱性亲水区。

螺旋－环－螺旋（HLH），HLH模体含有40多个氨基酸残基，在2个具有两性特征的α螺旋之间有一个长度可变的连接区（loop）。通过α螺旋的相互作用，HLH蛋白能够形成同源或异源二聚体，环的存在可以保证两个α螺旋独立的起作用。

主要的转录活化和抑制机制

活化机制：转录活化蛋白能够募集转录装置到特异基因启动子；转录活化蛋白能够募集有助于转录装置结合到

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基因启动子上的核小体修饰因子，如组蛋白乙酰化酶和染色质重塑复合物。 抑制机制： 1. 2.

的活化区。 3. 制转录。 4.

空间干扰和竞争

抑制，阻遏蛋白结合到活化蛋白旁侧的DNA结合位点并与活化蛋白相互作用，占据了活化蛋白

直接阻遏，阻遏蛋白结合到基因上游的位点，通过以某种形式与启动子上的转录装置相互作用抑间接阻遏，通过募集以抑制转录方式改变核小体的组蛋白修饰物来抑制转录。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/swr5.html